Summary

돼지 신장과 마우스 간에서 FAHD1 단백질의 추출 및 정제

Published: February 18, 2022
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Summary

이 프로토콜은 돼지 신장 및 마우스 간으로부터 푸마리아세토아세테이트 가수분해효소 도메인 함유 단백질 1(FAHD1)을 추출하는 방법을 기술한다. 열거된 방법들은 관심있는 다른 단백질에 적응될 수 있고 다른 조직에 대해 변형될 수 있다.

Abstract

푸마리아세토아세테이트 가수분해효소 도메인-함유 단백질 1 (FAHD1)은 진핵생물에서 FAH 수퍼패밀리의 최초로 확인된 구성원이며, 미토콘드리아에서 옥살로아세테이트 데카르복실라제로서 작용한다. 이 기사에서는 돼지 신장 및 마우스 간에서 FAHD1을 추출하고 정제하는 일련의 방법을 제시합니다. 다루는 방법은 빠른 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC)를 사용한 이온 교환 크로마토그래피, FPLC를 사용한 제조 및 분석 겔 여과 및 프로테오믹 접근법입니다. 총 단백질 추출 후, 황산암모늄 침전 및 이온 교환 크로마토그래피를 탐구하고, FAHD1은 이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하는 순차적 전략을 통해 추출되었다. 이러한 대표적인 접근법은 관심있는 다른 단백질(상당한 수준에서 발현됨)에 적응되고 다른 조직에 대해 변형될 수 있다. 조직으로부터 정제된 단백질은 고품질 항체 및/또는 강력하고 특이적인 약리학적 억제제의 개발을 지원할 수 있다.

Introduction

진핵 FAH 도메인-함유 단백질 1 (FAHD1)은 이관능성 옥살로아세테이트 (OAA) 탈카르복실라제 (ODx)1 및 아실피루베이트 가수분해효소 (ApH)2로서 작용한다. 그것은 미토콘드리아 2에 국한되어 있으며 효소 1,2,3,4,5,6의 광범위한 FAH 수퍼 패밀리에 속합니다. 그의 ApH 활성은 단지 미미한 관련성이 있는 반면, FAHD1의 ODx 활성은 TCA 사이클 플럭스 1,7,8,9의 조절에 관여한다. OAA는 트리카르복실산 사이클에서 중심 시트레이트 합성효소 반응에 필요할 뿐만 아니라 전자 수송 시스템의 일부로서 그리고 카타플레틱 대사산물로서 숙시네이트 데하이드로게나제의 경쟁적 억제제로서 작용한다. 인간 탯줄 정맥 내피 세포 (HUVEC)에서 FAHD1 유전자 발현의 하향 조절은 세포 증식 속도의 현저한 감소(10), 및 미토콘드리아 막 전위의 현저한 억제를 초래했으며, 이는 당분해로의 수반되는 전환과 관련되었다. 작업 모델은 미토콘드리아 기능 장애 관련 노화 (MiDAS)11 유사 표현형 8을 말하며, 여기서 미토콘드리아 OAA 수준은 FAHD1 활성 1,8,9에 의해 엄격하게 조절됩니다.

재조합 단백질은 조직보다는 박테리아(12)로부터의 발현 및 정제를 통해 수득하는 것이 더 쉽다. 그러나, 박테리아에서 발현된 단백질은 번역 후 변형의 가능한 부족에 의해 편향될 수 있거나, 또는 단순히 문제가 될 수 있다(즉, 플라스미드 손실, 박테리아 스트레스 반응, 왜곡/형성되지 않은 이황화 결합, 없음 또는 불량한 분비, 단백질 응집, 단백질 분해 절단 등). 특정 적용을 위해, 단백질은 그러한 변형을 포함하고/하거나 가능한 아티팩트를 배제하기 위해 세포 용해물 또는 조직으로부터 수득될 필요가 있다. 조직으로부터 정제된 단백질은 FAHD113과 같은 선택된 효소에 대한 고품질 항체 및/또는 강력하고 특이적인 약리학적 억제제의 개발을 지원한다.

이 원고는 돼지 신장과 마우스 간에서 FAHD1을 추출하고 정제하기위한 일련의 방법을 제시합니다. 기술된 방법에는 빠른 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC)가 필요하지만 그렇지 않으면 일반적인 실험실 장비를 사용합니다. 대안적인 방법들은 다른 곳에서 발견될 수 있다(14,15,16,17). 총 단백질 추출 후, 제안된 프로토콜은 황산암모늄 침전 및 이온 교환 크로마토그래피를 위한 서브프로토콜이 논의되는 테스트 단계를 포함한다(도 1). 이들 서브-프로토콜을 정의한 후에, 관심있는 단백질은 FPLC를 사용한 이온 교환 및 크기-배제 크로마토그래피를 사용하는 순차적 전략을 통해 추출된다. 이들 가이드라인에 기초하여, 최종 프로토콜은 관심있는 다른 단백질에 대해 개별적으로 적응될 수 있다.

Figure 1
그림 1: 이 프로토콜의 전반적인 전략. 위에서 아래로: 단백질은 조직에서 추출됩니다. 조직 균질액을 제조하고, 원심분리하고, 여과한다. 각 쌍의 상청액 및 펠렛 유래 샘플에 대해 황산암모늄 침전 및 이온 교환 크로마토그래피 (FPLC)에 대한 테스트를 수행하여 최적의 조건을 조사해야합니다. 이들 서브프로토콜을 확립한 후, 단백질은 다양한 pH 및 염 농도에서 황산암모늄 침전, 이온 교환 크로마토그래피 및 반복적 크기 배제 크로마토그래피(FPLC)의 순차적 절차를 통해 추출될 수 있다. 모든 단계는 웨스턴 블롯으로 제어해야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Protocol

모든 실험은 제도적 지침에 따라 수행되었다. 돼지 신장은 현지 슈퍼마켓에서 신선하게 얻어졌다. 간 조직은 Univ.-Doz의 감독하에 오스트리아 인스브루크 대학교 렌스벡 10, 6020 인스브루크의 생물의학 노화 연구소에서 유지된 C57BL6 야생형 마우스로부터 수확되었다. Pidder Jansen-Dürr 박사는 2013 년에 발행 된 프로젝트 리더로서 윤리적 허가를 받았습니다 (BMWF-66.008/0007-II/3b / 2013). 이 프로젝트에 대한 ?…

Representative Results

FAHD1 단백질은 제시된 프로토콜을 사용하여 돼지 신장 및 마우스 간으로부터 추출되었다. 마우스 조직의 경우, 최종 정제 단계 후에 수 μg을 얻기 위해서는 여러 장기가 필요합니다. 이러한 이유로이 기사는 돼지 신장에서 FAHD1을 추출하는 데 중점을 둡니다.이 실험은 훨씬 더 모범적 인 실험입니다. 마우스 간에서 FAHD1의 추출은이 프로토콜의 어려움과 가능한 함정을 제시하기 위해 수행됩니다. 일…

Discussion

프로토콜의 중요한 단계
단백질의 취급에 대한 일반적인 지침을 따르는 것은 얼음 작업과 적당한 pH 및 소금 조건에서 작업하는 것과 같이 필수적입니다. 프로테아제 억제제의 사용은 방법에 유익한 반면, 프로테아좀 억제제의 사용은 매우 권장됩니다. 샘플을 동결 및 해동하면 항상 (적어도 부분적으로) 단백질 침전이 발생할 수 있으므로 초기 단백질 용해물의 해동 분취량 (단계 2…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 Ayse Öztürk와 Eva Albertini의 기술 지원에 매우 감사드립니다. 간 조직의 생성에 사용된 마우스는 Univ.-Doz의 감독 하에 유지되었다. Pidder Jansen-Dürr 박사 (Innsbruck University, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Austria의 생물 의학 노화 연구 연구소).

Materials

0.22 µm filter units MERCK SLGP033RS Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril
0.45 µm filter units MERCK SLHP033NS Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril
15 mL Falcon tubes VWR 734-0451 centrifugal tubes
50 mL Falcon tubes VWR 734-0448 centrifugal tubes
96-Well UV Microplate Thermo-Fischer 8404 UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates
Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio) BIO-RAD #1610147 40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3.3% crosslinker) solution for casting polyacrylamide gels
ÄKTA FPLC system GE Healthcare Life Sciences / Cytiva using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system
Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa MERCK UFC901024 centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 15 mL
Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa MERCK UFC801024 centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 4 mL
Ammonium sulfate powder MERCK A4418 ammonium sulphate for molecular biology, ≥99.0%
Ammoniumpersulfat reagent grade, 98% MERCK 215589 Catalyst for acrylamide gel polymerization.
Coomassie Brilliant blue R 250 MERCK 1125530025 Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Trademark of Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 °C)
Dialysis tubing cellulose membrane MERCK D9277 Cellulose membranes for the exchange of buffers via dialysis.
Eppendof tubes 1.5 mL VWR 525-1042 microcentrifugal tubes; autoclaved
HiLoad 26/600 Superdex 75 pg GE Healthcare Life Sciences / Cytiva 28989334 HiLoad Superdex 75 pg prepacked columns are for high-resolution size exclusion chromatography of recombinant proteins
Immun-Blot PVDF Membrane BIO-RAD #1620177 PVDF membranes are protein blotting membranes optimized for fluorescent and multiplex fluorescent applications.
Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell BIO-RAD #1703930 Use the Mini Trans-Blot Cell for rapid blotting of Mini-PROTEAN precast and handcast gels.
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels BIO-RAD #1658004 4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam.
Mono Q 10/100 GL GE Healthcare Life Sciences / Cytiva 17516701 Mono Q columns are strong anion exchange chromatography columns for protein analysis or small scale, high resolution polishing of proteins.
Mono S 10/100 GL GE Healthcare Life Sciences / Cytiva 17516901 Mono S columns are strong cation exchange chromatography columns for protein analysis or small scale high resolution polishing of proteins.
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo-Fischer 26616 A mixture of 10 blue-, orange-, and green-stained proteins (10 to 180 kDa) for use as size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting.
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo-Fischer 23225 A two-component, high-precision, detergent-compatible protein assay for determination of protein concentration.
Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter Branson New models at https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf
Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated) Agilent Dako P0399 The antibody used for horseradish peroxidase conjugation reacts with rabbit immunoglobulins of all classes.
TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA MERCK T9281 TEMED (N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine) is molecule which allows rapid polymerization of polyacrylamide gels.
Tube Roller A general tube rotator roller; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71
Tube Rotator A general tube rotator wheel; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123
ULTRA-TURRAX; T 25 digital IKA 0003725000 New models at https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/

Referencias

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Andric, A., Wagner, E., Heberle, A., Holzknecht, M., Weiss, A. K. H. Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver. J. Vis. Exp. (180), e63333, doi:10.3791/63333 (2022).

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