Summary

Differensiering av humane pluripotente stamceller i betacelleforløpere i bukspyttkjertelen i et 2D-kultursystem

Published: December 16, 2021
doi:

Summary

Denne protokollen beskriver en forbedret metode for å øke kouttrykket av PDX1- og NKX6.1-transkripsjonsfaktorer i pankreasprogenitorer avledet fra humane pluripotente stamceller (hPSCer) i plane monolag. Dette oppnås ved å fylle opp den friske matrisen, manipulere celletettheten og dissosiere de endodermale cellene.

Abstract

Humane pluripotente stamceller (hPSCs) er et utmerket verktøy for å studere tidlig bukspyttkjertelutvikling og undersøke de genetiske bidragsyterne til diabetes. hPSC-avledede insulinutskillende celler kan genereres for celleterapi og sykdomsmodellering, men med begrenset effektivitet og funksjonelle egenskaper. hPSC-avledede pankreasprogenitorer som er forløpere til betaceller og andre endokrine celler, når de uttrykker de to transkripsjonsfaktorene PDX1 og NKX6.1, spesifiserer forfedrene til funksjonelle, insulinutskillende betaceller både in vitro og in vivo. hPSC-avledede pankreasprogenitorer brukes for tiden til celleterapi hos type 1 diabetespasienter som en del av kliniske studier. Nåværende prosedyrer genererer imidlertid ikke en høy andel av NKX6.1 og pankreasprogenitorer, noe som fører til samtidig generering av ikke-funksjonelle endokrine celler og få glukoseresponsive, insulinutskillende celler. Dette arbeidet utviklet dermed en forbedret protokoll for generering av hPSC-avledede pankreasprogenitorer som maksimerer samuttrykket av PDX1 og NKX6.1 i et 2D-monolag. Faktorene som celletetthet, tilgjengelighet av fersk matriks og dissosiasjon av hPSC-avledede endodermale celler moduleres som økte PDX1- og NKX6.1-nivåer i de genererte pankreasprogenitorene og minimerte forpliktelsen til alternativ leveravstamming. Studien fremhever at manipulering av cellens fysiske miljø under in vitro-differensiering kan påvirke avstamningsspesifikasjon og genuttrykk. Derfor letter den nåværende optimaliserte protokollen den skalerbare generasjonen av PDX1 og NKX6.1 som uttrykker forfedre for celleterapi og sykdomsmodellering.

Introduction

Diabetes er en kompleks metabolsk lidelse som påvirker millioner av mennesker globalt. Tilskudd av insulin anses som det eneste behandlingsalternativet for diabetes. Mer avanserte tilfeller behandles med betacelleerstatningsterapi, oppnådd ved transplantasjon av enten hele kadaveriske pankreas eller øyer 1,2. Flere problemer omgir transplantasjonsbehandling, for eksempel begrensning med tilgjengelighet og kvalitet på vevet, invasivitet av transplantasjonsprosedyrer i tillegg til det kontinuerlige behovet for immunosuppressive midler. Dette nødvendiggjør behovet for å oppdage nye og alternative alternativer for betacelleerstatningsterapi 2,3. Humane pluripotente stamceller (hPSCs) har nylig dukket opp som et lovende verktøy for å forstå human bukspyttkjertelbiologi og som en ikke-uttømmende og potensielt en mer personlig kilde for transplantasjonsbehandling 4,5,6,7. hPSCs, inkludert humane embryonale stamceller (hESCs) og menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPSCs), har høy selvfornyelseskapasitet og gir opphav til alle vevstyper i menneskekroppen. hESCs er avledet fra embryoets indre cellemasse, og hiPSCs omprogrammeres fra en hvilken som helst somatisk celle 4,8.

Rettet differensiering protokoller er optimalisert for å generere bukspyttkjertelen beta-celler fra hPSCs som sekvensielt direkte hPSCs gjennom bukspyttkjertelen utviklingsstadier invitro. Disse protokollene genererer hPSC-avledede øyorganoider. Mens de har forbedret seg sterkt ved å øke andelen betaceller i bukspyttkjertelen deri, er effektiviteten av protokoller svært variabel. Det øker ikke til mer enn ~40% av NKX6.1+/INSULIN+ eller C-PEPTIDE + celler 5,9,10,11,12,13. Imidlertid er de genererte betacellene ikke helt identiske med de voksne humane betacellene når det gjelder transkripsjonelle og metabolske profiler og deres respons på glukose 4,5,14. De hPSC-avledede betacellene mangler genuttrykk av viktige betacellemarkører som PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 og KCNK3 sammenlignet med voksne mennesker holmer5. I tillegg har de hPSC-avledede betacellene redusert kalsiumsignalering som respons på glukose. De er forurenset med de kogenererte polyhormonale cellene som ikke utskiller passende mengder insulin som svar på økende glukosenivå5. På den annen side kan hPSC-avledede pankreasprogenitorer, som er øyforløpere, genereres mer effektivt in vitro sammenlignet med beta-celler, og når de transplanteres in vivo, kan de modnes til funksjonelle, insulinutskillende betaceller15,16. Kliniske studier er for tiden fokusert på å demonstrere deres sikkerhet og effekt ved transplantasjon hos T1D-personer.

Spesielt er ekspresjon av transkripsjonsfaktorene PDX1 (Pancreas and Duodenal Homeobox 1) og NKX6.1 (NKX6 Homeobox 1) innenfor samme pankreasprogenitorcelle avgjørende for forpliktelse mot en betacellelinje5. Pankreasprogenitorer som ikke uttrykker NKX6.1 gir polyhormonale endokrine celler eller ikke-funksjonelle betaceller17,18. Derfor er et høyt kouttrykk av PDX1 og NKX6.1 i bukspyttkjertelen stamcellestadiet avgjørende for til slutt å generere et stort antall funksjonelle betaceller. Studier har vist at en embryoid kropp eller 3D-kultur forbedrer PDX1 og NKX6.1 i bukspyttkjertelen forfedre hvor differensierende celler er aggregert, varierende mellom 40% -80% av PDX1 + / NKX6.1 + befolkningen12,19. Imidlertid, sammenlignet med suspensjonskulturer, er 2D-differensieringskulturer mer kostnadseffektive, gjennomførbare og praktiske for bruk på flere cellelinjer5. Vi viste nylig at monolagdifferensieringskulturer gir mer enn 90% av PDX1+/NKX6.1+ meduttrykkende hPSC-avledede pankreasprogenitorer20,21,22. Den rapporterte metoden ga en høy replikeringskapasitet til de genererte pankreasprogenitorene og forhindret alternative skjebnespesifikasjoner som leverlinje21. Derfor demonstrerer denne protokollen en svært effektiv metode for differensiering av hPSCs til pankreas beta-celleforløpere som uttrykker PDX1 og NKX6.1. Denne metoden benytter teknikken for å dissosiere hPSC-avledet endoderm og manipulere celletettheten, etterfulgt av en utvidet FGF- og Retinoid-signalering samt Hedgehog-hemming for å fremme PDX1 og NKX6.1-samuttrykk (figur 1). Denne metoden kan legge til rette for en skalerbar generering av hPSC-avledede betacelleforløpere i bukspyttkjertelen for transplantasjonsbehandling og sykdomsmodellering.

Protocol

Studien er godkjent av den aktuelle institusjonelle forskningsetiske komité og utført i henhold til de etiske standarder som er fastsatt i Helsinkideklarasjonen fra 1964 og senere endringer eller sammenlignbare etiske standarder. Protokollen ble godkjent av Institutional Review Board (IRB) i HMC (nr. 16260/16) og Qatar Biomedical Research Institute (QBRI) (nr. 2016-003). Dette arbeidet er optimalisert for hESC-er som H1, H9 og HUES8. Blodprøver ble innhentet fra friske personer fra Hamad Medical Corporation (HMC) syke…

Representative Results

Resultatene viser at optimalisert protokoll P2-D (figur 1A) forbedret pankreasprogenitordifferensieringseffektivitet ved å oppregulere PDX1 og NKX6.1 samuttrykk (figur 2A, B og figur 3A). Spesielt viste resultatene at dissosiasjon av endodermale celler og deres replating på fersk membranmatrise sammen med en lengre varighet av trinn 3 forbedret NKX6.1-uttrykk i hPSC-avledede pankreasprogenitorer (optimalisert prot…

Discussion

Dette arbeidet beskriver en forbedret protokoll for generering av bukspyttkjertelprogenitorer fra hPSC-er med høyt samuttrykk av PDX1 og NKX6.1. Dissosiasjon og replating av den hPSC-avledede endodermen ved halv tetthet på fersk matriks resulterte i høyere PDX1 og NKX6.1 i hPSC-avledede pankreasprogenitorer.

Selv om vekstfaktorcocktailen for hvert trinn er svært lik P1-ND 27, har det vist seg at en mer utvidet trinn 3-behandling inkludert FGF og retinoidsignalering og BMP- og pinnsvinhemmi…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble finansiert av et stipend fra Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041).

Materials

15 mL, conical, centrifuge tubes Thermo Scientific 339651
20X TBS Tween 20 Thermo Scientific 28360
24-well culture plates, flat bottom with lid Costar 3524
50 mL, conical, centrifuge tubes Thermo Scientific 339652
6- well culture plates, multidish Thermo Scientific 140685
Accutase Stem Cell Technologies 0-7920
Activin A R&D 338-AC Reconstituted in 4 mM HCl
Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonal DSHB F55A12-C Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining
Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonal Abcam ab47308 Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining
B27 minus Vit A ThermoFisher 12587010
Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid free Sigma A7030
CHIR 99021 Tocris 4423 Reconstituted in DMSO
DMEM, high glucose ThermoFisher 41965047
Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 Invitrogen A10037
Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 A-21206
DPBS 1X ThermoFisher 14190144
EGF ThermoFisher PHG0313 Reconstituted in 0.1% BSA in PBS
FGF10 R&D 345-FG Reconstituted in PBS
Glucose Sigma Aldrich G8644
Hoechst 33258 Sigma 23491-45-4
Inverted microscope Olympus IX73
KnockOut DMEM/F-12 (1X) Gibco 12660-012
KnockOut SR serum replacement Gibco 10828-028
L-Ascorbic acid (vitamin C) Sigma A92902 Reconstituted in distilled water
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix Corning 354230 Aliquot the thawed stock and freeze at -20C.
MCDB131 ThermoFisher 10372019
Mouse anti-SOX17 ORIGENE CF500096 Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining
mTeSR Plus Stem Cell Technologies 85850 Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use
Nalgene filter units, 0.2 µm PES ThermoFisher 566-0020
Nicotinamide Sigma 72340 Reconstituted in distilled water
NOGGIN R&D 6057-NG Reconstituted in 0.1% BSA in PBS
Paraformaldehyde solution 4% in PBS ChemCruz sc-281692
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher 15140122
Portable vacuum aspirator
Rabbit anti-FOXA2 Cell signaling technology 3143 Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining
Retinoic Acid Sigma Aldrich R2625 Reconstituted in DMSO
Rock inhibitor (Y-27632) ReproCell 04-0012-02 Reconstituted in DMSO
Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILE Stellar Scientific FSC-9010
SANT-1 Sigma Aldrich S4572 Reconstituted in DMSO
Sodium bicarbonate Sigma S5761-500G
StemFlex ThermoFisher A3349401 Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use
TALI Cellular Analysis Slide Invitrogen T10794
Tali image-based cytometer automated cell counter Invitrogen T10796
Triton X-100 Sigma 9002-93-1
TrypLE 100 mL ThermoFisher 12563011
Tween 20 Sigma P2287
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Invitrogen 15575-038

Referencias

  1. Rickels, M. R., Robertson, R. P. Pancreatic islet transplantation in humans: Recent progress and future directions. Endocrine Reviews. 40 (2), 631-668 (2019).
  2. Latres, E., Finan, D. A., Greenstein, J. L., Kowalski, A., Kieffer, T. J. Navigating two roads to glucose normalization in diabetes: Automated insulin delivery devices and cell therapy. Cell Metabolism. 29 (3), 545-563 (2019).
  3. Vaithilingam, V., Tuch, B. E. Islet transplantation and encapsulation: An update on recent developments. Review of Diabetic Studies. 8 (1), 51-67 (2011).
  4. Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (6), 2459-2483 (2021).
  5. Memon, B., Abdelalim, E. M. Stem cell therapy for diabetes: Beta cells versus pancreatic progenitors. Cells. 9 (2), 283 (2020).
  6. Balboa, D., Iworima, D. G., Kieffer, T. J. Human pluripotent stem cells to model islet defects in diabetes. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 12, 642152 (2021).
  7. Gaertner, B., Carrano, A. C., Sander, M. Human stem cell models: Lessons for pancreatic development and disease. Genes & Development. 33 (21-22), 1475-1490 (2019).
  8. Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
  9. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  10. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  11. Nair, G. G., et al. Recapitulating endocrine cell clustering in culture promotes maturation of human stem-cell-derived β cells. Nature Cell Biology. 21 (2), 263-274 (2019).
  12. Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
  13. Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
  14. Hrvatin, S., et al. Differentiated human stem cells resemble fetal, not adult, β cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3038-3043 (2014).
  15. Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
  16. Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
  17. Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).
  18. Bruin, J. E., et al. Characterization of polyhormonal insulin-producing cells derived in vitro from human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 12 (1), 194-208 (2014).
  19. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  20. Memon, B., Abdelalim, E. M. Highly efficient differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Methods in Molecular Biology. , (2020).
  21. Memon, B., Karam, M., Al-Khawaga, S., Abdelalim, E. M. Enhanced differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 15 (2018).
  22. Aigha, I. I., Memon, B., Elsayed, A. K., Abdelalim, E. M. Differentiation of human pluripotent stem cells into two distinct NKX6.1 populations of pancreatic progenitors. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 83 (2018).
  23. Ali, G., et al. Keratinocytes derived from patient-specific induced pluripotent stem cells recapitulate the genetic signature of psoriasis disease. Stem Cells and Development. 29 (7), 383-400 (2020).
  24. Elsayed, A. K., et al. Generation of a human induced pluripotent stem cell line (QBRIi009-A) from a patient with a heterozygous deletion of FOXA2. Stem Cell Research. 42, 101705 (2020).
  25. Davenport, C., Diekmann, U., Budde, I., Detering, N., Naujok, O. Anterior-posterior patterning of definitive endoderm generated from human embryonic stem cells depends on the differential signaling of retinoic acid, Wnt-, and BMP-signaling. Stem Cells. 34 (11), 2635-2647 (2016).
  26. Schroeder, I. S., et al. Induction and selection of Sox17-expressing endoderm cells generated from murine embryonic stem cells. Cells Tissues Organs. 195 (6), 507-523 (2012).
  27. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  28. Elsayed, A. K., Younis, I., Ali, G., Hussain, K., Abdelalim, E. M. Aberrant development of pancreatic beta cells derived from human iPSCs with FOXA2 deficiency. Cell Death & Disease. 12 (1), 103 (2021).
  29. Mfopou, J. K., Chen, B., Mateizel, I., Sermon, K., Bouwens, L. Noggin, retinoids, and fibroblast growth factor regulate hepatic or pancreatic fate of human embryonic stem cells. Gastroenterology. 138 (7), 1-14 (2010).
  30. Mfopou, J. K., De Groote, V., Xu, X., Heimberg, H., Bouwens, L. Sonic hedgehog and other soluble factors from differentiating embryoid bodies inhibit pancreas development. Stem Cells. 25 (5), 1156-1165 (2007).
  31. Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: A dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).
  32. Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
  33. Shih, H. P., Panlasigui, D., Cirulli, V., Sander, M. ECM signaling regulates collective cellular dynamics to control pancreas branching morphogenesis. Cell Reports. 14 (2), 169-179 (2016).
  34. Raza, A., Ki, C. S., Lin, C. C. The influence of matrix properties on growth and morphogenesis of human pancreatic ductal epithelial cells in 3D. Biomaterials. 34 (21), 5117-5127 (2013).
  35. Lin, H. Y., et al. Fibronectin and laminin promote differentiation of human mesenchymal stem cells into insulin producing cells through activating Akt and ERK. Journal of Biomedical Science. 17, 56 (2010).
  36. Boretti, M. I., Gooch, K. J. Effect of extracellular matrix and 3D morphogenesis on islet hormone gene expression by Ngn3-infected mouse pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering Part A. 14 (12), 1927-1937 (2008).
  37. Boretti, M. I., Gooch, K. J. Induced cell clustering enhances islet beta cell formation from human cultures enriched for pancreatic ductal epithelial cells. Tissue Engineering. 12 (4), 939-948 (2006).
  38. Beattie, G. M., Rubin, J. S., Mally, M. I., Otonkoski, T., Hayek, A. Regulation of proliferation and differentiation of human fetal pancreatic islet cells by extracellular matrix, hepatocyte growth factor, and cell-cell contact. Diabetes. 45 (9), 1223-1228 (1996).
  39. Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), 82076 (2013).

Play Video

Citar este artículo
Memon, B., Abdelalim, E. M. Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells Into Pancreatic Beta-Cell Precursors in a 2D Culture System. J. Vis. Exp. (178), e63298, doi:10.3791/63298 (2021).

View Video