2D 배양 시스템에서 인간 만능줄기세포를 췌장 베타세포 전구체로 분화
Summary
본 프로토콜은 평면 단일층에서 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)로부터 유래된 췌장 전구세포에서 PDX1 및 NKX6.1 전사 인자의 동시 발현을 증가시키는 향상된 방법을 기술한다. 이것은 신선한 매트릭스를 보충하고, 세포 밀도를 조작하고, 내배엽 세포를 해리시킴으로써 달성됩니다.
Abstract
인간 만능 줄기 세포 (hPSC)는 초기 췌장 발달을 연구하고 당뇨병의 유전 적 기여자를 조사하기위한 훌륭한 도구입니다. hPSC 유래 인슐린 분비 세포는 세포 치료 및 질병 모델링을 위해 생성될 수 있지만, 제한된 효율성 및 기능적 특성을 갖는다. 베타 세포 및 기타 내분비 세포의 전구체인 hPSC 유래 췌장 전구세포는 두 전사 인자 PDX1 및 NKX6.1을 동시 발현할 때 시험관 내 및 생체 내 모두에서 기능적인 인슐린 분비 베타 세포에 대한 전구세포를 지정합니다. hPSC 유래 췌장 전구 세포는 현재 임상 시험의 일환으로 제1형 당뇨병 환자의 세포 치료에 사용됩니다. 그러나 현재의 절차는 NKX6.1 및 췌장 전구 세포의 높은 비율을 생성하지 않아 비 기능성 내분비 세포의 공동 생성과 포도당 반응성, 인슐린 분비 세포가 거의 없습니다. 따라서 이 연구는 2D 단층에서 PDX1과 NKX6.1의 동시 발현을 최대화하는 hPSC 유래 췌장 전구세포를 생성하기 위한 향상된 프로토콜을 개발했습니다. 세포 밀도, 신선한 기질의 가용성 및 hPSC 유래 내배엽 세포의 해리와 같은 요인이 조절되어 생성된 췌장 전구 세포에서 PDX1 및 NKX6.1 수준을 증가시키고 대체 간 계통에 대한 헌신을 최소화합니다. 이 연구는 시험관 내 분화 중에 세포의 물리적 환경을 조작하는 것이 계통 사양 및 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있음을 강조합니다. 따라서, 현재 최적화된 프로토콜은 세포 치료 및 질병 모델링을 위한 PDX1 및 NKX6.1 공동-발현 전구세포의 스케일러블한 생성을 용이하게 한다.
Introduction
당뇨병은 전 세계적으로 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치는 복잡한 대사 장애입니다. 인슐린 보충은 당뇨병의 유일한 치료 옵션으로 간주됩니다. 더 진행된 경우는 전체 사체 췌장 또는 섬 1,2의 이식을 통해 달성되는 베타 세포 대체 요법으로 치료됩니다. 이식 요법을 둘러싼 몇 가지 문제, 예를 들어 조직의 가용성 및 질에 대한 제한, 면역 억제제에 대한 지속적인 필요성 외에도 이식 절차의 침습성. 이를 위해서는 베타 세포 대체 요법 2,3에 대한 새롭고 대안적인 옵션을 발견 할 필요가 있습니다. 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)는 최근 인간 췌장 생물학을 이해하기위한 유망한 도구로 부상했으며 이식 요법 4,5,6,7을위한 완전하지 않고 잠재적으로 개인화 된 소스로 부상했습니다. 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 및 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)를 포함한 hPSC는 높은 자체 재생 능력을 가지며 인체의 모든 조직 유형을 생성합니다. hESC는 배아의 내부 세포 덩어리에서 파생되고 hiPSC는 모든 체세포 4,8에서 재 프로그래밍됩니다.
지시 분화 프로토콜은 시험관 내에서 췌장 발달 단계를 통해 hPSC를 순차적으로 지시하는 hPSC로부터 췌장 베타 세포를 생성하도록 최적화됩니다. 이러한 프로토콜은 hPSC 유래 췌도 오가노이드를 생성합니다. 그들은 그 안에 췌장 베타 세포의 비율을 증가시키는 데 크게 향상되었지만 프로토콜의 효율성은 매우 다양합니다. NKX40+/인슐린+ 또는 C-펩타이드+ 세포 5,9,10,11,12,13의 ~5,9% 이상으로 증가하지 않습니다. 그러나, 생성 된 베타 세포는 전사 및 대사 프로파일 및 포도당 4,5,14에 대한 반응 측면에서 성인 인간 베타 세포와 완전히 동일하지 않다. hPSC 유래 베타 세포는 성인 인간 섬5에 비해 PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 및 KCNK3와 같은 주요 베타 세포 마커의 유전자 발현이 부족합니다. 또한 hPSC 유래 베타 세포는 포도당에 대한 반응으로 칼슘 신호 전달을 감소시켰습니다. 그들은 포도당 수준 증가에 반응하여 적절한 양의 인슐린을 분비하지 않는 공동 생성 된 다 호르몬 세포로 오염됩니다5. 한편, 췌도 전구체인 hPSC 유래 췌장 전구체는 베타 세포에 비해 시험관 내에서 더 효율적으로 생성될 수 있고, 생체 내에 이식되면 기능적인 인슐린 분비 베타 세포(15,16)로 성숙할 수 있다. 임상 시험은 현재 T1D 피험자의 이식시 안전성과 효능을 입증하는 데 중점을두고 있습니다.
특히, 동일한 췌장 전구 세포 내에서 전사 인자 PDX1 (췌장 및 십이지장 호메오 박스 1) 및 NKX6.1 (NKX6 호메오 박스 1)의 발현은 베타 세포 계통5에 대한 헌신에 결정적이다. NKX6.1을 발현하지 못하는 췌장 전구 세포는 다 호르몬 내분비 세포 또는 비 기능성 베타 세포17,18을 생성합니다. 따라서, 췌장 전구 단계에서 PDX1과 NKX6.1의 높은 동시 발현은 궁극적으로 다수의 기능적 베타 세포를 생성하는 데 필수적이다. 연구에 따르면 배아 체 또는 3D 배양은 분화 세포가 응집되는 췌장 전구 세포에서 PDX1 및 NKX6.1을 향상 시키며 PDX1 + / NKX6.1+ 인구의 40 % -80 % 사이에서 다양합니다12,19. 그러나 현탁 배양에 비해 2D 분화 배양은 더 비용 효율적이고 실현 가능하며 여러 세포주에 적용하기에 편리합니다5. 우리는 최근에 단층 분화 배양이 hPSC 유래 췌장 전구 세포 20,21,22를 공동 발현하는 PDX1+/NKX6.1+ 동시 발현의 최대90% 이상을 산출한다는 것을 보여주었습니다. 보고된 방법은 생성된 췌장 전구체에 높은 복제 능력을 부여하고 간 계통21과 같은 대체 운명 사양을 방지했습니다. 따라서, 본원에서, 이 프로토콜은 hPSCs를 PDX1 및 NKX6.1을 공동-발현하는 췌장 베타-세포 전구체로 분화시키기 위한 매우 효율적인 방법을 입증한다. 이 방법은 hPSC 유래 내배엽을 해리하고 세포 밀도를 조작한 다음 확장된 FGF 및 레티노이드 신호 전달과 고슴도치 억제를 통해 PDX1 및 NKX6.1 동시 발현을 촉진하는 기술을 활용합니다(그림 1). 이 방법은 이식 요법 및 질병 모델링을 위한 hPSC 유래 췌장 베타-세포 전구체의 확장가능한 생성을 촉진할 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구는 PDX1 및 NKX6.1의 높은 공동 발현을 갖는 hPSC로부터 췌장 전구 세포를 생성하기위한 향상된 프로토콜을 설명합니다. 신선한 매트릭스에서 절반 밀도에서 hPSC 유래 내배엽의 해리 및 재 도금은 hPSC 유래 췌장 전구 세포에서 더 높은 PDX1 및 NKX6.1을 초래했습니다.
각 단계에 대한 성장 인자 칵테일은 P1-ND 27과 매우 유사하지만, FGF 및 레티노이드 신호 전달 및 BMP 및 고슴도치…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 카타르 국립 연구 기금 (QNRF) (보조금 번호. NPRP10-1221-160041).
Materials
| 15 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 20X TBS Tween 20 | Thermo Scientific | 28360 | |
| 24-well culture plates, flat bottom with lid | Costar | 3524 | |
| 50 mL, conical, centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
| 6- well culture plates, multidish | Thermo Scientific | 140685 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 0-7920 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | Reconstituted in 4 mM HCl |
| Anti NKX6.1 antibody, mouse monoclonal | DSHB | F55A12-C | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| Anti-PDX1 antibody, guinea pig polyclonal | Abcam | ab47308 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:1000 for immunostaining |
| B27 minus Vit A | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin, heat shock fraction, fatty acid free | Sigma | A7030 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | Reconstituted in DMSO |
| DMEM, high glucose | ThermoFisher | 41965047 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H + L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | A-21206 | ||
| DPBS 1X | ThermoFisher | 14190144 | |
| EGF | ThermoFisher | PHG0313 | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| FGF10 | R&D | 345-FG | Reconstituted in PBS |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8644 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 23491-45-4 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX73 | |
| KnockOut DMEM/F-12 (1X) | Gibco | 12660-012 | |
| KnockOut SR serum replacement | Gibco | 10828-028 | |
| L-Ascorbic acid (vitamin C) | Sigma | A92902 | Reconstituted in distilled water |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | Aliquot the thawed stock and freeze at -20C. |
| MCDB131 | ThermoFisher | 10372019 | |
| Mouse anti-SOX17 | ORIGENE | CF500096 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:2000 for immunostaining |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 85850 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| Nalgene filter units, 0.2 µm PES | ThermoFisher | 566-0020 | |
| Nicotinamide | Sigma | 72340 | Reconstituted in distilled water |
| NOGGIN | R&D | 6057-NG | Reconstituted in 0.1% BSA in PBS |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| Portable vacuum aspirator | |||
| Rabbit anti-FOXA2 | Cell signaling technology | 3143 | Diluted to 1:100 for flow-cytometry and 1:500 for immunostaining |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625 | Reconstituted in DMSO |
| Rock inhibitor (Y-27632) | ReproCell | 04-0012-02 | Reconstituted in DMSO |
| Round Bottom Polystyrene FACS Tubes with Caps, STERILE | Stellar Scientific | FSC-9010 | |
| SANT-1 | Sigma Aldrich | S4572 | Reconstituted in DMSO |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| StemFlex | ThermoFisher | A3349401 | Mix the basal media with supplement. Aliquot and store at -20 °C for longer time or at 4 °C for instant use |
| TALI Cellular Analysis Slide | Invitrogen | T10794 | |
| Tali image-based cytometer automated cell counter | Invitrogen | T10796 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| TrypLE 100 mL | ThermoFisher | 12563011 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |
Referencias
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