Optogenetischer Phasenübergang von TDP-43 in spinalen Motoneuronen von Zebrafischlarven

Ribonukleoprotein (RNP)-Granula steuern eine Vielzahl von zellulären Aktivitäten im Zellkern und Zytoplasma, indem sie membranlose Trennwände über Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) zusammensetzen, ein Phänomen, bei dem eine homogene Flüssigkeit in zwei verschiedene flüssige Phasen ^zerlegt1,2. Das dysregulierte LLPS von RNA-bindenden Proteinen, die normalerweise als RNP-Granulatkomponenten fungieren, fördert einen abnormalen Phasenübergang, der zur Proteinaggregation führt. Dieser Prozess wurde mit neurologischen Entwicklungs- und neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung ^{gebracht3,4,5}. Die genaue Bewertung eines kausalen Zusammenhangs zwischen aberrantem LLPS von RNA-bindenden Proteinen und der Krankheitspathogenese ist entscheidend dafür, ob und wie LLPS als wirksames therapeutisches Ziel genutzt werden kann. LLPS von RNA-bindenden Proteinen ist relativ einfach in vitro und in einzelligen Modellen zu untersuchen, ist aber in mehrzelligen Organismen, insbesondere bei Wirbeltieren, schwierig. Eine kritische Voraussetzung für die Analyse eines solchen LLPS in einzelnen Zellen innerhalb einer Gewebeumgebung besteht darin, eine Sonde für die Bildgebung und Manipulation von LLPS in einem krankheitsgefährdeten Zelltyp von Interesse stabil auszudrücken.

Die Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine letztlich tödliche neurologische Erkrankung, bei der Motoneuronen des Gehirns und des Rückenmarks durch Degeneration selektiv und progressiv verloren gehen. Bis heute wurden Mutationen in mehr als 25 Genen mit der vererbbaren (oder familiären) Form von ALS in Verbindung gebracht, die 5% -10% der gesamten ALS-Fälle ausmacht, und einige dieser ALS-verursachenden Gene kodieren RNA-bindende Proteine, die aus RNPs bestehen, wie hnRNPA1, TDP-43 und ^FUS6,7. Darüber hinaus ist die sporadische Form von ALS, die 90% -95% der gesamten ALS-Fälle ausmacht, durch die zytoplasmatische Aggregation von TDP-43 gekennzeichnet, die in degenerierenden Motoneuronen abgelagert wird. Ein Hauptmerkmal dieser ALS-assoziierten RNA-bindenden Proteine sind ihre intrinsisch ungeordneten Regionen (IDRs) oder Domänen mit geringer Komplexität, denen geordnete dreidimensionale Strukturen fehlen und die schwache Protein-Protein-Interaktionen mit vielen verschiedenen Proteinen vermitteln, die LLPS ^antreiben7,8. Die Tatsache, dass ALS-verursachende Mutationen häufig in den IDRs auftreten, hat zu der Idee geführt, dass aberrantes LLPS und Phasenübergang dieser ALS-verwandten Proteine der ALS-Pathogenese zugrunde liegen ^könnten9,10.

Vor kurzem wurde die optoDroplet-Methode, eine Cryptochrome 2-basierte optogenetische Technik, die die Modulation von Protein-Protein-Interaktionen durch Licht ermöglicht, entwickelt, um den Phasenübergang von Proteinen mit ^IDRs11 zu induzieren. Da diese Technik erfolgreich auf TDP-43 ausgeweitet wurde, hat sie begonnen, die Mechanismen aufzudecken, die dem pathologischen Phasenübergang von TDP-43 und der damit verbundenen Zytotoxizität zugrunde liegen12,13,14,15. In diesem Protokoll skizzieren wir eine genetische Methode zur Abgabe eines optogenetischen TDP-43 an ALS-gefährdete Zelltypen, nämlich spinale Motoneuronen im Zebrafisch unter Verwendung des BAC für das mnr2b/mnx2b-Gen, das für ein homöodomänes Protein für die Motoneuronspezifikation ^kodiert16,17. Die hohe Transluzenz von Zebrafischlarven ermöglicht eine einfache, nichtinvasive Lichtstimulation des optogenetischen TDP-43, die seinen Phasenübergang in den spinalen Motoneuronen auslöst. Wir präsentieren auch einen grundlegenden Workflow für die Live-Bildgebung der Zebrafisch-Spinalmotorneuronen und die Bildanalyse mit der frei verfügbaren Fiji/ImageJ-Software, um die Reaktionen des optogenetischen TDP-43 auf die Lichtstimulation zu charakterisieren. Diese Methoden ermöglichen eine Untersuchung des TDP-43-Phasenübergangs in einer ALS-gefährdeten zellulären Umgebung und sollten dazu beitragen, seine pathologischen Folgen auf zellulärer und Verhaltensebene zu untersuchen.