Transición de fase optogenética de TDP-43 en neuronas motoras espinales de larvas de pez cebra
Summary
Describimos un protocolo para inducir la transición de fase de la proteína 43 de unión al ADN TAR (TDP-43) por la luz en las neuronas motoras espinales utilizando el pez cebra como modelo.
Abstract
La agregación anormal de proteínas y la vulnerabilidad neuronal selectiva son dos características principales de las enfermedades neurodegenerativas. Las relaciones causales entre estas características pueden interrogarse mediante el control de la transición de fase de una proteína asociada a la enfermedad en un tipo de célula vulnerable, aunque este enfoque experimental ha sido limitado hasta ahora. Aquí, describimos un protocolo para inducir la transición de fase de la proteína de unión al ARN / ADN TDP-43 en las neuronas motoras espinales de larvas de pez cebra para modelar la agregación citoplasmática de TDP-43 que ocurre en las neuronas motoras degeneradas en la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Describimos un método genético basado en el cromosoma artificial bacteriano (BAC) para administrar una variante optogenética de TDP-43 selectivamente a las neuronas motoras espinales del pez cebra. La alta translucidez de las larvas de pez cebra permite la transición de fase del TDP-43 optogenético en las neuronas motoras espinales mediante una simple iluminación externa utilizando un diodo emisor de luz (LED) contra peces sin restricciones. También presentamos un flujo de trabajo básico de imágenes en vivo de las neuronas motoras espinales del pez cebra y análisis de imágenes con el software Fiji / ImageJ disponible gratuitamente para caracterizar las respuestas del TDP-43 optogenético a la iluminación de la luz. Este protocolo permite la caracterización de la transición de fase de TDP-43 y la formación de agregados en un entorno celular vulnerable a la ELA, lo que debería facilitar la investigación de sus consecuencias celulares y de comportamiento.
Introduction
Los gránulos de ribonucleoproteína (RNP) controlan una miríada de actividades celulares en el núcleo y el citoplasma mediante el ensamblaje de particiones sin membrana a través de la separación de fase líquido-líquido (LLPS), un fenómeno en el que un fluido homogéneo se demezcla en dos fases líquidas distintas1,2. El LLPS desregulado de las proteínas de unión al ARN que normalmente funcionan como componentes de gránulos RNP promueve la transición de fase anormal, lo que lleva a la agregación de proteínas. Este proceso se ha implicado en enfermedades del neurodesarrollo y neurodegenerativas3,4,5. La evaluación precisa de una relación causal entre el LLPS aberrante de las proteínas de unión al ARN y la patogénesis de la enfermedad es crucial para determinar si y cómo el LLPS puede ser explotado como un objetivo terapéutico eficaz. El LLPS de proteínas de unión al ARN es relativamente fácil de estudiar in vitro y en modelos unicelulares, pero es difícil en organismos multicelulares, especialmente en vertebrados. Un requisito crítico para analizar dicho LLPS en células individuales dentro de un entorno tisular es expresar de manera estable una sonda para la obtención de imágenes y la manipulación de LLPS en un tipo de interés celular vulnerable a la enfermedad.
La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es un trastorno neurológico finalmente mortal en el que las neuronas motoras del cerebro y la médula espinal se pierden selectiva y progresivamente debido a la degeneración. Hasta la fecha, las mutaciones en más de 25 genes se han asociado con la forma hereditaria (o familiar) de ELA, que representa el 5%-10% del total de casos de ELA, y algunos de estos genes causantes de ELA codifican proteínas de unión al ARN que consisten en RNP, como hnRNPA1, TDP-43 y FUS6,7. Además, la forma esporádica de ELA, que representa el 90%-95% del total de casos de ELA, se caracteriza por la agregación citoplasmática de TDP-43 depositada en neuronas motoras degeneradas. Una característica importante de estas proteínas de unión al ARN asociadas a la ELA son sus regiones intrínsecamente desordenadas (IDR) o dominios de baja complejidad que carecen de estructuras tridimensionales ordenadas y median interacciones proteína-proteína débiles con muchas proteínas diferentes que impulsan LLPS7,8. El hecho de que las mutaciones causantes de ELA ocurran a menudo en los IDR ha llevado a la idea de que el LLPS aberrante y la transición de fase de estas proteínas relacionadas con la ELA pueden ser la base de la patogénesis de la ELA9,10.
Recientemente, se desarrolló el método optoDroplet, una técnica optogenética basada en Cryptochrome 2 que permite la modulación de las interacciones proteína-proteína por la luz, para inducir la transición de fase de proteínas con IDRs11. A medida que esta técnica se ha extendido con éxito a TDP-43, se han comenzado a descubrir los mecanismos subyacentes a la transición de fase patológica de TDP-43 y su citotoxicidad asociada12,13,14,15. En este protocolo, esbozamos un método genético para administrar un TDP-43 optogenético a tipos de células vulnerables a la ELA, a saber, las neuronas motoras espinales en el pez cebra utilizando el BAC para el gen mnr2b / mnx2b que codifica una proteína homeodominio para la especificación de la neurona motora16,17. La alta translucidez de las larvas de pez cebra permite una estimulación lumínica simple y no invasiva del TDP-43 optogenético que desencadena su transición de fase en las neuronas motoras espinales. También presentamos un flujo de trabajo básico para la obtención de imágenes en vivo de las neuronas motoras espinales del pez cebra y el análisis de imágenes utilizando el software Fiji / ImageJ disponible gratuitamente para caracterizar las respuestas del TDP-43 optogenético a la estimulación de la luz. Estos métodos permiten una investigación de la transición de fase de TDP-43 en un entorno celular vulnerable a la ELA y deberían ayudar a explorar sus consecuencias patológicas a nivel celular y conductual.
Protocol
Representative Results
Discussion
La expresión mediada por mnr2b-BAC de opTDP-43h y EGFP-TDP-43z en pez cebra proporciona una oportunidad única para la obtención de imágenes en vivo de la transición de fase de TDP-43 en las neuronas motoras espinales. La transparencia óptica de los tejidos corporales de las larvas de pez cebra permite la estimulación optogenética simple y no invasiva de opTDP-43h. Las comparaciones entre neuronas motoras espinales individuales a lo largo del tiempo demostraron que la oligomerización dependiente de la lu…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por SERIKA FUND (KA), KAKENHI Grant números JP19K06933 (KA) y JP20H05345 (KA).
Materials
| Confocal microscope | Olympus | FV1200 | |
| Epifluorescence microscope | ZEISS | Axioimager Z1 | |
| Fluorescence stereomicroscope | Leica | MZ16FA | |
| Glass base dish | IWAKI | 3910-035 | |
| Incubator | MEE | CN-25C | |
| LED panel | Nanoleaf Limited | Nanoleaf AURORA smarter kit | |
| Mupid-2plus | TAKARA | AD110 | |
| NucleoBond BAC100 | MACHEREY-NAGEL | 740579 | |
| NuSieve GTG Agarose | LONZA | 50181 | |
| Objective lens | Olympus | XLUMPlanFL N 20×/1.00 | |
| Objective lens | ZEISS | Plan-Neofluar 5x/0.15 | |
| Optical power meter | HIOKI | 3664 | |
| Optical sensor | HIOKI | 9742-10 | |
| Phenol red solution 0.5% | Merck | P0290-100ML | |
| PrimeSTAR GXL DNA Polymerase | TAKARA | R050A | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Six-well dish | FALCON | 353046 | |
| Spectrometer probe BLUE-Wave | StellerNet Inc. | VIS-50 | |
| Syringe needle | TERUMO | NN-2725R | |
| TaKaRa Ex Taq | TAKARA | RR001A | |
| Tricane | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Zebrafish BAC clone CH211-172N16 | BACPAC Genomics | CH211-172N16 |
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