Medición de la β-oxidación de ácidos grasos en una suspensión de hepatocitos de ratón recién aislados
Summary
La β oxidación de ácidos grasos es una vía metabólica esencial responsable de generar energía en muchos tipos de células diferentes, incluidos los hepatocitos. Aquí, describimos un método para medir la β oxidación de ácidos grasos en hepatocitos primarios recién aislados utilizando ácido palmítico marcado con 14C.
Abstract
La β oxidación de ácidos grasos es una vía metabólica clave para satisfacer las demandas de energía del hígado y proporcionar sustratos y cofactores para procesos adicionales, como la cetogénesis y la gluconeogénesis, que son esenciales para mantener la homeostasis de la glucosa de todo el cuerpo y apoyar la función de los órganos extrahepáticos en el estado de ayuno. La β oxidación de ácidos grasos ocurre dentro de las mitocondrias y los peroxisomas y se regula a través de múltiples mecanismos, incluida la absorción y activación de ácidos grasos, los niveles de expresión enzimática y la disponibilidad de cofactores como la coenzima A y NAD +. En los ensayos que miden la β oxidación de ácidos grasos en homogeneizados hepáticos, la lisis celular y la adición común de niveles suprafisiológicos de cofactores enmascaran los efectos de estos mecanismos reguladores. Además, la integridad de los orgánulos en los homogeneizados es difícil de controlar y puede variar significativamente entre preparaciones. La medición de la β oxidación de ácidos grasos en hepatocitos primarios intactos supera las trampas anteriores. Este protocolo describe un método para la medición de la β oxidación de ácidos grasos en una suspensión de hepatocitos primarios de ratón recién aislados incubados con ácido palmítico marcado con 14C. Al evitar horas o días de cultivo, este método tiene la ventaja de preservar mejor los niveles de expresión de proteínas y la actividad de la vía metabólica del hígado original, incluida la activación de la β oxidación de ácidos grasos observada en hepatocitos aislados de ratones en ayunas en comparación con ratones alimentados.
Introduction
La β-oxidación de ácidos grasos es un proceso esencial en el metabolismo de los lípidos, proporcionando una vía catabólica para equilibrar la síntesis de ácidos grasos y la ingesta de la dieta. Este proceso genera energía para múltiples órganos, incluidos el músculo cardíaco, la corteza renal y el hígado en ayunas, y utiliza ácidos grasos obtenidos de la dieta, la lipólisis del tejido adiposo y las reservas internas de triglicéridos 1,2.
La oxidación de los ácidos grasos a través de la vía de β-oxidación da como resultado el acortamiento secuencial de la cadena de acilo graso por dos carbonos a la vez, liberados como acetil-CoA, y este proceso ocurre tanto en las mitocondrias como en los peroxisomas. Mientras que la mayoría de los ácidos grasos sufren sólo β-oxidación, algunos se oxidan en diferentes carbonos antes de entrar en esta vía. Por ejemplo, los ácidos grasos sustituidos por 3-metilo, como el ácido fitánico, se someten a la eliminación de un carbono por α-oxidación en los peroxisomas antes de entrar en la vía de β-oxidación. Del mismo modo, algunos ácidos grasos se convierten primero en ácidos grasos dicarboxílicos por oxidación del grupo metilo terminal (ω-oxidación) en el retículo endoplásmico antes de ser oxidados preferentemente en los peroxisomas por β-oxidación3.
Independientemente del orgánulo específico, un ácido graso primero debe convertirse en un tioéster de coenzima A (CoA), o acil-CoA, para oxidarse a través de la vía de β oxidación. β-Oxidación de acil-CoAs de cadena larga en la matriz mitocondrial requiere el transbordador de carnitina para su translocación, donde la carnitina palmitoiltransferasa 1 (CPT1) cataliza la conversión de acil-CoAs en acilcarnitinas y es la enzima limitante de velocidad en este proceso4. Una vez translocados a la matriz mitocondrial, los acil-CoAs se vuelven a formar y sirven como sustratos para la maquinaria mitocondrial de β-oxidación. En el estado de ayuno, el acetil-CoA producido a través de la β-oxidación en las mitocondrias hepáticas se canaliza principalmente a la cetogénesis. Los peroxisomas sirven como el sitio principal para la β-oxidación de los ácidos grasos de cadena muy larga, cadena ramificada y dicarboxílicos. Los peroxisomas no requieren el transbordador de carnitina para importar sustratos de ácidos grasos, sino que importan los correspondientes acilo-CoAs a través de la actividad de los transportadores de casete de unión a ATP (ABC) ABCD1-35. Dentro de los peroxisomas, los acil-CoAs son oxidados por un conjunto dedicado de enzimas, distintas de la maquinaria de β oxidación de ácidos grasos mitocondriales. Tanto las mitocondrias como los peroxisomas también requieren un suministro de NAD + y CoA libre para oxidar las cadenas de acilo graso. Se ha demostrado que los niveles de CoA en el hígado aumentan en respuesta al ayuno, lo que respalda el aumento de la tasa de oxidación de ácidos grasos que ocurre en este estado6. Además, el aumento de la degradación de CoA en los peroxisomas resulta en una disminución selectiva de la oxidación de ácidos grasos peroxisomales7. Por lo tanto, el proceso de oxidación de ácidos grasos dentro de la célula está regulado por los niveles de expresión y las actividades de las enzimas involucradas en la activación, transporte y oxidación de los ácidos grasos, así como las concentraciones de cofactores y otros metabolitos a través de múltiples compartimentos subcelulares.
Los procedimientos que utilizan homogeneizados de tejidos para medir la oxidación de ácidos grasos destruyen la arquitectura celular que regula y apoya este proceso, lo que lleva a una recopilación de datos que no reflejan con precisión el metabolismo in vivo. Si bien las técnicas que utilizan hepatocitos primarios chapados preservan este sistema, el cultivo de células aisladas durante largos períodos de tiempo resulta en una pérdida del perfil de expresión génica in vivo que estaba presente en las células cuando todavía vivían dentro del animal 8,9. El siguiente protocolo describe un método para aislar los hepatocitos primarios y evaluar su capacidad de β-oxidación de ácidos grasos inmediatamente después del aislamiento y en suspensión, utilizando [1-14C]ácido palmítico. El ensayo se basa en la medición de la radiactividad asociada con los metabolitos solubles en ácido (MAPE) o productos, como el acetil-CoA, producidos por la β-oxidación del ácido palmítico [1-14C]10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante la perfusión hepática, es fundamental evitar la introducción de burbujas de aire, ya que bloquean los microcapilarios en el hígado, impidiendo o restringiendo la circulación tampón y disminuyendo en general el rendimiento y la viabilidad de los hepatocitos20,21. Las precauciones, como inspeccionar de cerca la línea de entrada llena de tampón antes de la canulación del IVC y evitar levantar la línea de entrada del tubo que contiene el tampón 1 p…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la subvención R35GM119528 de los Institutos Nacionales de Salud a Roberta Leonardi.
Materials
| (R)-(+)-Etomoxir sodium salt | Tocris Bioscience | 4539/10 | |
| [1-14C]-Palmitic acid, 50–60 mCi/mmol, 0.5 mCi/mL | American Radiolabeled Chemicals | ARC 0172A | |
| 1 M HEPES, sterile | Corning | 25060CI | |
| 10 µL disposable capillaries/pistons for positive displacement pipette | Mettler Toledo | 17008604 | |
| 1000 µL, 200 µL, and 10 µL pipettes and tips | |||
| 5 mL, 10 mL, and 25 mL serological pipettes | |||
| 50 mL sterile centrifuge tubes | CellTreat | 229421 | |
| 70% Perchloric acid | Fisher Scientific | A2296-1LB | |
| BSA, fatty acid-free | Fisher Scientific | BP9704100 | |
| CaCl2 dihydrate | MilliporeSigma | 223506 | |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7021 | |
| EGTA | Gold Biotechnology | E-217 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200CSPP | |
| Filter System, 0.22 μm PES Filter, 500 mL, Sterile | CellTreat | 229707 | |
| Gentamicin sulphate | Gold Biotechnology | G-400-25 | |
| HDPE, 6.5 mL scintillation vials | Fisher Scientific | 03-342-3 | |
| Hemocytometer | |||
| Hypodermic needles 22 G, 1.5 in | BD Biosciences | 305156 | |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| KH2PO4 | MilliporeSigma | P5655 | |
| Liberase TM Research Grade | MilliporeSigma | 5401119001 | Defined blend of purified collagenase I and II with a medium concentration of thermolysin |
| M199 medium | MilliporeSigma | M5017 | |
| MgSO4 heptahydrate | MilliporeSigma | M1880 | |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5980 | |
| NaCl | Chem-Impex International | 30070 | |
| NaHCO3 | Acros Organics | 424270010 | |
| Palmitic acid | MilliporeSigma | P0500 | |
| Penicillin/streptomycin (100x) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cytiva Life Sciences | SH30256.01 | |
| Positive displacement pipette MR-10, 10 µL | Mettler Toledo | 17008575 | |
| Refrigerated centrifuge with inserts for 50 mL conical tubes | Eppendorf | 5810 R | |
| Round-bottom, 14 mL, polypropylene culture test tubes | Fisher Scientific | 14-956-9A | |
| Scintillation counter | Perkin Elmer | TriCarb 4810 TR | |
| ScintiVerse BD cocktail | Fisher Scientific | SX18-4 | |
| Shaking water bath, 30 L capacity | New Brunswick Scientific | Model G76 | |
| Sterile cell strainers, 100 µm | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Thumb Dressing Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | RS-8120 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Variable-flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 138762 | |
| Water baths, 2–2.5 L capacity |
Referencias
- Alves-Bezerra, M., Cohen, D. E. Triglyceride Metabolism in the Liver. Comprehensive Physiology. 8 (1), 1-8 (2017).
- Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. Myocardial fatty acid metabolism in health and disease. Physiological Reviews. 90 (1), 207-258 (2010).
- Mannaerts, G. P., van Veldhoven, P. P. Functions and organization of peroxisomal beta-oxidation. Annals of the New York Academy of Sciences. 804, 99-115 (1996).
- Kerner, J., Hoppel, C. Fatty acid import into mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1486 (1), 1-17 (2000).
- Baker, A., et al. Peroxisomal ABC transporters: functions and mechanism. Biochemical Society Transactions. 43 (5), 959-965 (2015).
- Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state. PloS One. 5 (6), 11107 (2010).
- Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver. Journal of Lipid Research. 60 (5), 1005-1019 (2019).
- Richert, L., et al. Gene expression in human hepatocytes in suspension after isolation is similar to the liver of origin, is not affected by hepatocyte cold storage and cryopreservation, but is strongly changed after hepatocyte plating. Drug Metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals. 34 (5), 870-879 (2006).
- Colbert, R. A., Amatruda, J. M., Young, D. A. Changes in the expression of hepatocyte protein gene-products associated with adaptation of cells to primary culture. Clinical Chemistry. 30 (12), 2053-2058 (1984).
- Spurway, T. D., Sherratt, H. A., Pogson, C. I., Agius, L. The flux control coefficient of carnitine palmitoyltransferase I on palmitate beta-oxidation in rat hepatocyte cultures. Biochemical Journal. 323, 119-122 (1997).
- Consitt, L. A., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1alpha overexpression increases lipid oxidation in myocytes from extremely obese individuals. Diabetes. 59 (6), 1407-1415 (2010).
- Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50615 (2013).
- Lilly, K., Chung, C., Kerner, J., VanRenterghem, R., Bieber, L. L. Effect of etomoxiryl-CoA on different carnitine acyltransferases. Biochemical Pharmacology. 43 (2), 353-361 (1992).
- Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J. Rates of mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation of palmitate change during postnatal development and food deprivation in liver, kidney and heart of pigs. Journal of Nutrition. 127 (9), 1814-1821 (1997).
- Yu, X. X., Drackley, J. K., Odle, J., Lin, X. Response of hepatic mitochondrial and peroxisomal beta-oxidation to increasing palmitate concentrations in piglets. Biology of the Neonate. 72 (5), 284-292 (1997).
- Veerkamp, J. H., van Moerkerk, H. T. Peroxisomal fatty acid oxidation in rat and human tissues. Effect of nutritional state, clofibrate treatment and postnatal development in the rat. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 875 (2), 301-310 (1986).
- Hakvoort, T. B., et al. Interorgan coordination of the murine adaptive response to fasting. Journal of Biological Chemistry. 286 (18), 16332-16343 (2011).
- Sokolovic, M., et al. The transcriptomic signature of fasting murine liver. BMC Genomics. 9, 528 (2008).
- Kersten, S., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha mediates the adaptive response to fasting. Journal of Clinical Investigation. 103 (11), 1489-1498 (1999).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Ng, I. C., et al. Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (170), e62289 (2021).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3917 (2012).
- Fulgencio, J. P., Kohl, C., Girard, J., Pegorier, J. P. Effect of metformin on fatty acid and glucose metabolism in freshly isolated hepatocytes and on specific gene expression in cultured hepatocytes. Biochemical Pharmacology. 62 (4), 439-446 (2001).
- Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance. Diabetologia. 57 (7), 1466-1475 (2014).
- Bougarne, N., et al. PPARalpha blocks glucocorticoid receptor alpha-mediated transactivation but cooperates with the activated glucocorticoid receptor alpha for transrepression on NF-kappaB. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7397-7402 (2009).
- Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).
