Messung der Fettsäure-β-Oxidation in einer Suspension frisch isolierter Maus-Hepatozyten

Fettsäure-β-Oxidation ist ein essentieller Prozess im Fettstoffwechsel und bietet einen katabolen Weg, um die Fettsäuresynthese und -aufnahme aus der Nahrung auszugleichen. Dieser Prozess erzeugt Energie für mehrere Organe, einschließlich des Herzmuskels, der Nierenrinde und der nüchternen Leber, und verwendet Fettsäuren, die aus der Nahrung, der Fettgewebelipolyse und den internen Triglyceridspeichern^{gewonnen werden 1,2}.

Die Oxidation von Fettsäuren durch den β-Oxidationsweg führt zur sequentiellen Verkürzung der Fettacylkette um zwei Kohlenstoffe gleichzeitig, die als Acetyl-CoA freigesetzt werden, und dieser Prozess findet sowohl in den Mitochondrien als auch in den Peroxisomen statt. Während die meisten Fettsäuren nur einer β-Oxidation unterzogen werden, werden einige an verschiedenen Kohlenstoffen oxidiert, bevor sie in diesen Weg eintreten. Zum Beispiel werden 3-methylsubstituierte Fettsäuren, wie Phytansäure, durch α-Oxidation in den Peroxisomen entfernt, bevor sie in den β-Oxidationsweg eintreten. Ebenso werden einige Fettsäuren zunächst durch Oxidation der terminalen Methylgruppe (ω-Oxidation) im endoplasmatischen Retikulum in Dicarbonsäuren umgewandelt, bevor sie in den Peroxisomen durch β-Oxidation bevorzugt oxidiert^{werden 3}.

Unabhängig von der spezifischen Organelle muss eine Fettsäure zunächst in einen Coenzym A (CoA)-Thioester oder Acyl-CoA umgewandelt werden, um über den β-Oxidationsweg oxidiert zu werden. β-Oxidation von langkettigen Acyl-CoAs in der mitochondrialen Matrix benötigt das Carnitin-Shuttle für ihre Translokation, wobei Carnitin-Palmitoyltransferase 1 (CPT1) die Umwandlung von Acyl-CoAs in Acylcarnitine katalysiert und das geschwindigkeitsbegrenzende Enzym in diesem Prozess^{ist 4}. Nach der Translokation in die mitochondriale Matrix werden die Acyl-CoAs neu geformt und dienen als Substrate für die mitochondriale β-Oxidationsmaschinerie. Im nüchternen Zustand wird das durch β-Oxidation in den hepatischen Mitochondrien erzeugte Acetyl-CoA hauptsächlich zur Ketogenese geleitet. Peroxisomen dienen als primärer Ort für die β-Oxidation von sehr langkettigen, verzweigtkettigen und dicarbonsäurehaltigen Fettsäuren. Peroxisomen benötigen das Carnitin-Shuttle nicht, um Fettsäuresubstrate zu importieren, sondern importieren die entsprechenden Acyl-CoAs durch die Aktivität der ATP-bindenden Kassettentransporter (ABC) ABCD1-3⁵. Innerhalb der Peroxisomen werden Acyl-CoAs dann durch einen speziellen Satz von Enzymen oxidiert, die sich von der mitochondrialen Fettsäure- β-Oxidationsmaschine unterscheiden. Sowohl Mitochondrien als auch Peroxisomen benötigen auch eine Zufuhr von NAD⁺ und freiem CoA, um Fettacylketten zu oxidieren. Es wurde gezeigt, dass der CoA-Spiegel in der Leber als Reaktion auf das Fasten ansteigt, was die erhöhte Rate der Fettsäureoxidation unterstützt, die in diesem Zustand auftritt⁶. Darüber hinaus führt ein erhöhter CoA-Abbau in den Peroxisosomen zu einer selektiven Abnahme der peroxisomalen Fettsäureoxidation⁷. Daher wird der Prozess der Fettsäureoxidation innerhalb der Zelle durch die Expressionsniveaus und Aktivitäten von Enzymen reguliert, die an der Aktivierung, dem Transport und der Oxidation von Fettsäuren beteiligt sind, sowie durch die Konzentrationen von Cofaktoren und anderen Metaboliten in mehreren subzellulären Kompartimenten.

Verfahren, bei denen Gewebehomogenate zur Messung der Fettsäureoxidation verwendet werden, zerstören die zelluläre Architektur, die diesen Prozess reguliert und unterstützt, was zu einer Sammlung von Daten führt, die den In-vivo-Stoffwechsel nicht genau widerspiegeln. Während Techniken, die plattierte primäre Hepatozyten verwenden, dieses System erhalten, führt die Kultivierung isolierter Zellen über längere Zeiträume zu einem Verlust des In-vivo-Genexpressionsprofils, das in den Zellen vorhanden war, als sie noch im Tier lebten ^8,9. Das folgende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Isolierung primärer Hepatozyten und zur Bestimmung ihrer Fettsäure- β-Oxidationskapazität unmittelbar nach der Isolierung und in Suspension unter Verwendung von [^1-14C]Palmitinsäure. Der Assay basiert auf der Messung der Radioaktivität, die mit den säurelöslichen Metaboliten (ASM) oder Produkten wie Acetyl-CoA assoziiert ist, die durch die ^β-Oxidationvon [1-14 C]palmitinsäure^10,11 erzeugt werden.