数据的信号与噪声比是执行微晶 X 射线衍射测量中最重要的考虑因素之一。VMXm 光束线为此类实验提供了低噪音环境和微束。在这里,我们描述了 VMXm 和其他微焦大分子晶体光束线的安装和冷却微晶体的样品制备方法。
单晶低温晶体学的微晶(<10 μm)的安装提出了一个非平凡的挑战。随着光束线光学、光束稳定性和变光束尺寸从亚微米到微米的聚焦,例如钻石光源1的 VMXm 光束线的发展,微晶数据质量得到了改善。通过改善样品环境和样品制备,将进一步改善数据质量。微晶本身产生较弱的衍射,因此改善信号到噪声是收集高质量 X 射线衍射数据的关键,主要来自背景噪声的降低。衍射实验中X射线背景噪声的主要来源来自它们与样品前后空气路径的相互作用、样品周围的过量结晶溶液、结晶冰的存在以及从任何其他光束线仪器或X射线窗口散射而来。VMXm 光束线包括仪器和样品制备协议,以减少所有这些噪音源。
首先,VMXm 的真空采样环境可消除 X 射线源和样品之间的空气路径。其次,VMXm 大分子晶体学的样品制备协议利用了许多从低温技术中改编的工艺和工具。其中包括铜网格与孔碳支持膜,自动印迹和暴跌冷却机器人利用液体乙烷。这些工具能够在单个低温TEM网格上制备数百个微晶,在低噪音支持下使用最少的周围液体。它们还最大限度地减少了晶体周围任何剩余液体的结晶冰的形成。
在将样品安装到 VMXm 光束线上进行 X 射线衍射实验之前,我们介绍了使用可见光和扫描电子显微镜制备和评估可溶性蛋白质微晶体质量的过程。我们还将提供高质量样品以及需要进一步优化和战略的样品示例。
通过大分子晶体学(MX)确定生物分子高分辨率结构的主要障碍仍然是以适宜的尺寸生产衍射良好的晶体。实现这一目标的策略有很多,从重组蛋白基因结构设计到大型稀疏矩阵搜索化学鸡尾酒,可能会产生初始晶体2。对于后者,晶体学家往往需要优化任何初始命中,以获得具有足够衍射质量和大小的晶体,用于结构确定研究3。尽管有这些选择,一些目标分子可能永远不会产生大(>10 μm),很好地衍射晶体,因此晶体学家必须坚持他们的微晶和这些样品的挑战。这些措施包括适当安装和低温保护晶体,管理固有的较弱的衍射和提高辐射敏感性。微晶是由比较大的晶体更少的单位细胞和分子形成的,因此,衍射与较大的晶体相比不会放大到同样的程度,从而产生固有的较弱的衍射强度。重要的是,背景信号不能掩盖这些反射,特别是在更高的分辨率,弱反射强度可以失去4。此外,微晶对辐射损伤更敏感,尽管在液氮温度5时记录了衍射,但可能无法从单个晶体中收集完整数据,因此有必要从大量晶体中收集数据,以生成一个完整的数据集6。
X 射线自由电子激光器 (XFELs) 的日益普及以及串行晶体学方法 (SFX)7 的演变为从较小的微晶收集数据提供了途径。然而,这些都是定制的样品递送方法,这需要大量的硬件和软件专业知识,其中实验仅限于室温,通常样品消耗高(数百微升),仍然可能需要进一步优化8。因此,只能进行数量有限的微晶的项目不适合 SFX。
与此同时,同步加速器光束技术近几十年来已发展到生产更小,更稳定的光束9与辉煌,允许数据收集从越来越小的晶体10,11。微焦光束线,如NSLS-II的FMX和钻石光源的I24,已经能够从最大尺寸为+3 μm12的晶体中确定新的结构,并证明能够从更小的晶体中收集可用数据,尺寸为±1微米13。光束线必须精确配置,具有出色的高分辨率轴视光学元件、样品旋转的极小混淆球体以及与 X 射线束重合的精确对齐旋转轴。重要的是要密切匹配X射线束轮廓与晶体体积,并确保晶体精确对齐的X射线束 – 水晶的挑战<5 μm14。在光束线上满足这些实验条件对于记录微晶中质量最好的数据至关重要。
从微晶体收集数据的剩余和可能最重要的方面是晶体向X射线束的显示。微晶体通常安装在微米样品安装件上,由聚酰胺制成,聚酰胺是一种低X射线散射材料,光圈小至10微米15,16。聚酰胺网被安装在一个标准针,设置为磁性脊柱基座,使其与大多数MX光束线17兼容。网状坐骑通常采用与使用标准回路式安装安装 100 μm 晶体相同的程序,从结晶滴中捞取晶体。虽然晶体可能分布在网格上,但一个关键缺点是,在收获时,网状物和针脚可以携带相对大量的液体(图1C,D)。这种液体体积比晶体本身大很多倍,当用X射线照射时,会助致背景噪音。如果液体在闪光冷却过程中形成结晶冰,则此背景散射可能更强,从而降低冰衍分辨率内本已弱强度的信号与噪声比。因此,从样品中去除多余的液体是确保记录所有可能的信号的关键。在脂质立方相(LCP)内形成的膜蛋白晶体中,这一挑战更大,LCP产生强大的背景散射,也很难从晶体周围去除。
钻石光源的全新多功能大分子晶体学微焦 (VMXm) 光束线为从可能尺寸小于一微米的晶体收集数据提供了条件。光束线设计用于提供测量 0.3 μm x 0.5 μm (VxH)1的光束轮廓、一个混淆范围不超过 60 nm 的流光度计和一个 真空 样本环境。VMXm 端站的这些设计特点最大限度地减少了光束设备在数据收集过程中产生的背景 X 射线噪声,而样本14产生的背景来源最大。
专为 VMXm 光束线设计的特定示例制备方法提供了减少此背景并进一步改善衍射数据的信号到噪声的机会,最大限度地提高了可从测量< 10 μm 的微晶记录的数据的质量。这里概述的许多关于微晶低背景衍射的要求也常见于低温传输电子显微镜(低温)19和微晶电子衍射(微ED)20。因此,已经为低温TEM样品的制备开发的许多工具适合进行一些适应,用于微晶的制备。在为单粒子低温TEM准备样品时,所调查的粒子嵌入非常薄的层(通常 <为100纳米)的层中,使电子能够通过样品传输。薄均匀层通过清除多余的液体来实现,样品的光度通过快速冷却样品(+104 Ks-1)21通过跳入保存在+93 K22的液态乙烷中来实现。相比之下,液氮,通常用于MX样品制备,是一种效率低于乙烷的低温,在样品21中具有更大的晶体冰形成倾向。晶体冰的形成,可以降解衍射和产生背景噪音,通常通过使用低温保护化合物23缓解。低分子量聚合物,如聚乙烯乙二醇(PEG)400和甲基-2,4-五氯苯酚(MPD),糖,油或饱和盐可以添加到低浓度24结晶溶液的盐 – 没有”一刀切”的解决方案来选择最合适的低温保护剂,这通常需要优化25.晶体在采集和冷冻保护过程中也经过多次操作,可能导致晶体受损,利用液态乙烷的机会允许忽略这一步骤,并有助于保护晶体的完整性。
虽然液态乙烷是微晶(<10 μm)的有效低温源,但由于样品的稀薄,有防止晶体结冰的替代方法,特别是在较大的晶体中,包括使用严格控制的潮湿环境26降低晶体的含水量,或通过将多余的液体从晶体27的环和表面排出但是,这些再次需要对样品进行更大的操作。使用自动印迹和与液体乙烷的暴跌冷冻,如在低温TEM,一起删除多余的结晶解决方案,并提供一种手段,以控制的方式闪烁冷却微晶体,同时试图尽量减少操作。
在这里,我们提出了一个协议,不仅可以由VMXm光束线的用户和其他微焦光束线收集高信号到噪声衍射数据,但也可能有助于那些准备可溶性蛋白质晶体和洗涤剂为基础的膜蛋白晶体样品进行微ED实验。虽然 VMXm 提供所有准备和评估样品的设施,但许多结构生物学实验室越来越多地配备低温TEM 样品制备设备。因此,我们设想一些用户可能希望使用自己的设施,在 VMXm 上准备样品,以备不时之用。
该协议演示了冷冻TEM样品制备工具如何用于在微焦光束线上进行X射线衍射实验的微晶制备。标准光束线仪表以针安装样品为中心,虽然已努力为微晶安装提供样品支持,但它们通常难以加载样品,同时确保实现最高信号到噪声(图 1C,D)。其中许多样品可能还需要优化低温保护条件,以确保样品是四肢的。暴跌冷冻方法提供了一种可重复的方式,以去除多余的液体,并在高效低温中闪烁冷却样品(图1A,B)。然后,网格可以安装在标准光束线上,并安装有基于钳子的引脚安装,VMXm 样品支架经过专门设计,通过导电冷却将网格接收到真空环境中的玻璃过渡温度以下。VMXm 的样本环境支持低背景数据收集,其中样本是背景的剩余来源,并提供了可用于匹配尺寸小于 10 μm 的晶体的微光束。这种样品制备方法还可用于为电子衍射准备纳米晶体,因为电子渗透力弱,因此对超量液体和四维样品也要求很少。虽然低温TEM网格很脆弱,但那些在循环中采集晶体的经验将迅速适应网格的处理。由于经验丰富,在协议的印迹、冻结和加载阶段,很少会丢失网格。然而,优化步骤对于这一成功至关重要,仔细准备将减少失去晶体或降低晶体完整性的机会。
CryoTEM 电网提供了一个相对较大的单个支架,可以容纳数百个晶体,从而提高了吞吐量,而可能只能记录一小块衍射数据楔形。单个网格也可以提供足够的晶体来确定蛋白质结构,特别是在高对称晶体中。如果只有一两个单个结晶滴产生微晶,则仅对结晶条件进行试印有助于确保当微晶被弄脏时,所用时间尽可能接近生成初始优质样品所需的时间。碳膜支架对 X 射线不可见,并且具有不同的孔间距,可用于适应特定的形态。我们最常使用 2 μm 孔的支撑膜,间距为 2 μm,但间距较大的小孔可能更适合小于 2 μm 的晶体。其他支持膜(如 1 μm 孔、4 μm 间距)以及具有不同形状孔的支持膜,所有这些都将影响印迹时间。网格方网大小为 200(每英寸 200 平方),也为铜网格条之间提供了足够的空间(+100 μm),使 X 射线束不会与铜强相互作用,同时为装有晶体的碳膜提供足够的结构支持。液体乙烷的使用否定了对低温保护剂的需求,进而减少了对样品体积的要求,而样品量本来会用于优化低温保护条件。
在此过程中要优化的主要参数是印迹时间和样品稀释。印迹时间应该足够长,在暴跌冻结之前观察整个网格的”弹出”效果。过度印迹可能导致晶体脱水,但是,控制样品室内的湿度是为了尽量减少这种影响。虽然建议使用相对湿度为 90%,但某些样品可能有助于优化湿度。湿度可能会影响印迹纸的印迹效率,而印迹纸会慢慢饱和水。此外,样品室内的湿度控制可用于提高晶体30的衍射质量。建议在检查衍射完整性之前对湿度进行小的更改(<5%),以确保衍射质量不会降解。
非珍贵样品的优化可以使用光显微镜代替SEM进行。虽然具有破坏性,但它有助于评估整个网格晶体的密度,并有助于决定样品应稀释还是浓缩以更好地分散整个网格中的晶体。当有大量的晶体可用,特别是高度集中的样品时,此步骤最有用。应避免将晶体聚集在一起(图3),因为如果在数据收集过程中同时点亮两颗晶体,则不是大问题,因为晶体团周围可能会有更大的液体量,从而减少信号到噪声(图5)。虽然使用光显微镜可以观察全球电网中大量液体的过量,但只能使用装有低温真空转移系统和舞台的电子显微镜来评估微晶周围的液体体积和结晶冰的存在。有时,在将晶体应用于网格并发生印迹之前,低粘度溶液中的晶体可能会沿着网格的一个边缘沉淀。我们发现,将乙二醇最终浓度加起来达到50%,可以减缓晶体通过滴流的移动,确保微晶在电网中更好地分布,并通过增加印迹时间(图3D)对印迹进行更好的控制。
一些含有粘性沉淀剂(如高分子量 PEG)的结晶溶液可能难以抹黑,需要越来越长的印迹时间(>10s)。在这种情况下,有助于减少沉积在网格背面的液体体积以及包含晶体的溶液体积,以支持网格的胶片侧。策略,如使用2层印迹纸或玻璃纤维也可能有助于印迹在这些困难的情况下31。
虽然这种管道适用于可溶性蛋白质晶体,但在非常粘稠的介质(如 LCP 中的膜蛋白)中形成的晶体提出了不同的挑战,而此协议不适合这些挑战。然而,正在制定战略,在低温TEM网格上为微教育制备LCP晶体,其中包括通过诱导LCP的阶段变化来降低样品的粘度。这允许样品以与本文中描述的方式类似的方式应用于网格。最后,样品可以用聚焦离子束碾磨,以去除多余的非晶体材料32,33,34。
总体而言,此管道通常需要 1-2 小时(包括设备设置时间),从到达 VMXm 的样品到提供分布良好、经过维尔庄化的样品的优化网格,具体取决于样品可用性、晶体浓度和结晶溶液的粘度。这些方法已经成功地用于为X射线衍射实验准备微晶,探索微晶体的辐射损伤,其中样品周围最小体积的液体是必不可少的28,35。应当指出,该协议可以应用于所有可溶性微晶体样品,而不仅仅是对已经优化的散射良好的样品。生产微晶材料的结晶实验传统上是优化的目标,目的是获得更大的晶体,但是,这种样品制备方法和 VMXm 的能力可能允许在没有进一步优化的情况下从这些样品中收集到足够的数据。或者,如果这种微晶样品衍射不良,使用这种样品制备方法从VMXm收集的数据仍然可以作为进一步优化结晶条件的有用指南。用于准备网格的工具,包括发光放电和骤降冻结,现已在配备低温TEM实验的研究机构中广泛提供,许多用户将能够在 VMXm 的光束时间之前准备样品。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢杰里米·基恩、乔恩·格里姆斯、杰夫·萨顿和戴夫·斯图亚特、牛津大学和南安普敦大学的雷切尔·博尔顿,他们除了为光束线启用外,还为VMXm光束线的样品制备方法的开发和演示提供了微晶样品。作者还要感谢 iNEXT 发现(项目编号871037)在出版此手稿方面提供的机会和支持。
Automated Cryo-EM plunge freezing instrument | Leica or ThermoFisher | Various | |
Benchtop light microscope with light source | Various | Various | |
Blade/Scalpel | Fisher Scientific | Various | |
CryoTEM Copper 200 mesh grids with carbon support film with 2 µm holes | Quantifoil | N1-C16nCu20-50 | |
CryoTEM grid storage boxes | Agar Scientific | AGG3727 | |
ddH2O | n/a | n/a | |
Ethane gas supply | n/a | n/a | |
Ethylene Glycol | Acros Organics | 146750010 | |
Glass microscope slides | FisherBrand | 12383118 | |
Glass petri dish | FisherBrand | 455732 | |
Glow discharging device | Pelco | 91000S | |
Laboratory wrapping film (Parafilm) | Bemis | HS234526B | |
Large and small, fine forceps | Agar Scientific | Various | |
Liquid nitrogen supply | n/a | n/a | |
Pipette tips | Various | Various | |
Pipetting devices | Various | Various | |
Sealing tape for crystallisation plates. | Molecular Dimensions | MD6-01 | |
Small/medium liquid nitrogen dewars | Spearlab | Various | |
Sprung circlip clipping tool | Subangstrom | SCT08 | |
Whatmann No.1 pre-cut filter paper | Leica | 16706440 |