VMXmビームラインにおける微結晶のサンプル調製パイプライン

1. 機器のセットアップ 注:ここで説明する方法は、単一のブロッティングアームを備えたプランジ冷凍器具を使用しています。いくつかの機器は2つのブロットアームが装備されており、我々は1つのブロッティングアームが使用されるように、機器を調整するためにメーカーの指示を確認することをお勧めします。 顕微鏡とプランジフリーザーの両方がユーザーの手の届きやすいように、軽い顕微鏡がプランジ凍結器具の近くに配置されていることを確認してください。 メーカーの指示に従って、自動プランジ冷凍庫をセットアップして冷却します。注:サンプルチャンバー温度は、結晶が成長した温度に設定する必要があります。ブロッティングペーパーをサンプルチャンバーに入れないでください。注意:液体エタンは非常に可燃性の爆発物であり、潜在的な火花源から離れた換気の良い領域でのみ使用する必要があります。 グリッドボックスに適切なラベルを付け、液体窒素を使用して小さなデュワーでそれらを冷却します。 グリッドを慎重に配置し、カーボンフィルム側を上に、グロー放電のための適切なキャリア(パラフィルムで包まれたガラス顕微鏡スライドなど)上に置きます。 グロー放電クライオテムグリッドは、15 mAの電流を使用して、0.39 mBarで25 sのクライオテムグリッドを放電します。グリッドが使用される直前のグロー放電。準備ができるまで覆われたペトリ皿にグロー排出グリッドを保ちます。グロー放電後に30分経過した場合は、グロー放電を繰り返します。注:プランジ冷凍庫の準備ができて、グリッドを準備すると、注意がサンプルに向けることができます。 2. 初期ブロッティングパラメータの決定 サンプルチャンバの相対湿度を90%、ブロッティング時間を5 sに設定し、ブロッティングが完了した後にプランジフリーザーが自動的にサンプルを突っ込むように設定されていることを確認します。注:これらの開始パラメータは、Leica GPプランジ冷凍庫に最も適しており、ブロット力などの他のパラメータは、FEI Vitrobotで利用可能です。しかし、我々の経験では、結晶の完全性は、単一のブロッティングアームの使用によって維持される可能性が高い。 目的の井戸が開いたら結晶化トレイを密封できるように、テープの小さなストリップをカットし、一方の端に折り畳んでシールの開口部を容易にするタブを作成し、慎重に片側に配置します。 リザーバーを含む結晶化ウェルの上にシールを切り開きます。速やかに作業し、2~5 μLのリザーバー溶液を水晶含有液に塗布し、液量を低下に維持します。 テープのタブを使用してウェルを再密封し、結晶化液が乾燥しないようにします。 一時的に結晶化井戸の上にテープを開いたままにして、リザーバ溶液の10 μLを0.5 mLチューブに移して、後のステップで使用します。 井戸を再シールします。 プランジ冷凍器具のブロッティングアームに、プレカットのブロッティングペーパーを置きます。 単一のグロー排出グリッドをプランジ凍結鉗子に入れ、カーボン側がブロッティングアームから離れて向き合うよう機器に積み込みます。 ブロッティングチャンバー内の相対湿度が90%であることを確認してください。 カーボンフィルム側がブロッティングアームに向かるように鉗子を回転させます。 2.5 μL ピペットを使用して、0.5 mL チューブから、cryoTEM グリッドの非支持(光沢のある銅)側に 2 μL のリザーバー溶液を塗布します。 グリッドを回転させて、炭素支持側がブロッティングアームから離れた方向に向き合い、プロセスを繰り返し、グリッドのカーボンフィルム支持側に慎重に液体を塗布します。カーボンフィルムを傷つけずにピペットチップでカーボンフィルムに触れないようにしてください。液体は、グロー放電中に堆積した電荷のためにグリッド全体に広がる必要があります。 グリッドを観察しながらブロッティングプロセスを開始します。この目的のために、Leica GP2で視聴範囲を利用できます。 この間、液体がグリッドの炭素表面から引き出されるかどうかを観察し、これは液体がグリッドを通って邪悪になると平坦化グリッド上の液体ボーラスの大部分から始まります。各グリッドの正方形の液体がさらに減少するにつれて、グリッドの表面を横切る「飛び出す」波が観察される。この効果が観察された場合、ブロットは、ポップ効果終了の2〜3s以内に停止することができます。廃棄できるテストグリッドを突き落とす必要はありません。 いわゆる「飛び出す」効果が観察されない場合は、ステップ2.11-2.14を繰り返し、ブロッティングアームがグリッドから引き込まれる直前に飛び出す効果が観察されるまで、ブロッティング時間を1〜2 s延長します。この時間は手順 3 に注意してください。注:このポッピング効果が発生するとすぐにブロッティングが停止し、プロセス中に結晶が過ブロッティングから脱水されないようにすることが重要です。サンプルのバックブロッティングと希釈のためにリザーバからの結晶化溶液を使用して、結晶が一貫した溶液の対象となることを保証し、結晶を不安定化させるリスクを低減します。 3. 結晶の収穫 結晶化プレートを光顕微鏡の下に置き、視野内にターゲットを十分に配置します。 新鮮なグロー放電グリッドをプランジフリーザー鉗子に入れ、カーボンフィルム側をブロッティングアームから離して、プランジフリーザーに鉗子を取り付けます。 カーボンフィルム側がブロッティングアームに向かるように鉗子を回転させます。 2.5 μL ピペットを使用して、0.5 mL チューブから 2 μL のリザーバー溶液を cryoTEM グリッドの非支持側に塗布し、グリッドを回転させて、カーボンフィルム支持側がプランジフリーザーのサンプルポートに面するようにします。 一時的なシールを剥がし、ピペットを2μLに設定して、結晶化液を繰り返し軽く吸引して微結晶を吊り下げます(気泡をドロップに導入しないことが重要です)。注:このプロセスを光顕微鏡で観察して、表面の皮膚やウェルの基部から結晶が放出されるようにすることが重要です。結晶が付け込まれ、吸引性を持って描かれていない場合は、ピペット先端または鍼治療針などの他の結晶化ツールを、結晶を穏やかに外すために使用することができる。光顕微鏡の結晶の大きさや被写界深度によっては、顕微鏡を用いて、ピペット先端に入る結晶を見ることもできる場合がある。 吸引したマイクロクリスタルスラリーの2μLをプランジフリーザーに移し、すべてのサンプルをクライオテムグリッドのカーボン側に塗布します。 ステップ2で決定された時間のブロットとすぐにプランジ凍結を開始します。ブロッティング中に、グリッド全体で波の波の効果が発生するのを観察し、これがグリッド全体で完全に発生したかどうかを確認します。結晶の存在は、初期のブロッティング時間に影響を与える可能性があり、これは1-2 sで後続のグリッドのために調整する必要があります。 迅速に作業し、液体エタンから液体窒素に浸したグリッドボックスにグリッドを転送します。残留エタンは、液体窒素に入ると、グリッド上の不透明な白色固体に変えることができます。これを減らすには、液体エタンからグリッドを着実に取り出し、液体窒素貯蔵所に素早く移します。 グリッドボックスに4グリッドを配置したら、ネジで箱の蓋を固定し、液体窒素の泡デュワーに移して、スキャン電子顕微鏡(SEM)でさらなるサンプル評価を行うか、適切な貯蔵容器を使用して液体窒素貯蔵デュワーに移します。 4. 光顕微鏡によるサンプル密度評価 注意: この方法は破壊的です。1つまたは2つの結晶化液滴など、サンプルの入手が限られている場合は、このステップをスキップすることをお勧めします。プランジ凍結サンプル(ステップ3.7)の後、グリッド全体の結晶の分布を評価することができます。 ドライ、室温のクライオテムグリッドをプランジフリーザー鉗子に取り付け、グリッドを視野に入れて、光顕微鏡の側に鉗子を置きます。グリッド全体と個々のグリッドの正方形を解決できるように、適切な倍率と焦点を設定します。 手順 3.1 ~ 3.7 に従ってください。 グリッドをグリッドボックス(ステップ3.8)に転送する代わりに、プランジ冷凍庫をリセットして、液体エタンからプランジされたグリッドを引き込みます。注意: グリッドとサンプルは室温まで暖かく、それ以上の回折実験には使用できません。 プランジ冷凍器具から鉗子を取り外します。 鉗子の中にグリッドを保持しながら、光顕微鏡の下にグリッドを置く – 焦点はすでにおおよそ設定されます。 細かい焦点を実行し、グリッド全体の結晶の密度を評価します。良いグリッドは、各グリッドの正方形内のグリッドバーから離れていくつかの孤立した結晶が含まれ、結晶の束は最小限です。 グリッド内の結晶の密度が、わずか数個の単離された結晶で結晶の束を生じさせる場合、さらにリザーバー溶液で結晶スラリーを希釈し、ステップ3を繰り返します。希釈によって結晶が溶解しないように、サンプルを希釈する際には注意してください。 0.5~1 μLの少量を使用して、水晶を薄くします。 5. 走査型電子顕微鏡によるサンプル評価 注:クライオテムグリッド上のマイクロクリスタル製剤は、極低温条件下で走査型電子顕微鏡(SEM)で最もよく評価され、これはクライオステージを装着したSEMで達成することができます。VMXmでは、クォーラムPP3006エアロックとクライオステージを備えたJEOL JSM-IT100 SEM(タングステンソース)が利用されています。VMXm28、29でサンプルを表示する際の放射線損傷を最小限に抑えるために、次の設定が使用されます: 5 kV加速電圧;スポットサイズは40(JEOL JSM-IT100の任意の単位)10 mmの作業距離。画像は二次電子検出器を使用して記録され、サンプルの位置合わせと焦点を合わせるのに0.8μsの位取り時間が使用され、16μsの位取り時間を使用して単結晶の高解像度画像がキャプチャされます。サンプルをSEMにロードする前に、顕微鏡がメーカーの指示に従って整列することが重要です。同じパラメータで準備された残りのグリッドはX線回折実験用に予約されている間、SEMにロードされるグリッドは1つだけであることをお勧めします。 メーカーの指示に従って、サンプルのクライオステージを-180°Cに冷却してSEMを準備します。cryoTEM グリッドを利用可能な特定のシステムにロードするための指示に従ってください。 SEMにサンプルをロードして、電子ビームをオンにし、サンプルを整列させ、高倍率(0.8 μsのドウェル時間)を使用して焦点を合わせます。 まず、グリッド全体を低倍率(x45)で初期評価を実行します。この倍率で画像を記録します。 個々のグリッドの正方形の詳細な検査を可能にするために拡大を増やす、個々の結晶は非常に明確に観察可能でなければなりません。 グリッド内を移動し、静止画像(16 μsのデュエルタイム)をキャプチャして、次の要件を満たしていることを確認してから次の要件を満たします。 グリッドが平らで、カーボン支持フィルムが大部分がそのままであることを確認してください。 結晶を取り巻くガラス化された液体の狭いハローを持つ多数の単結晶があることを確認してください。 炭素支持フィルムの穴が見えるようにしてください。 暗くて滑らかな外観で定義されるガラス化された液体の大きな領域がないことを確認します。 六角形の氷、または表面の氷がグリッド全体に散らばっていることを確認します。 結晶が支持フィルム全体に均等に分布し、重ならないようにしてください。 この時点で、多数の結晶の寸法を正確に測定し、後の回折実験中に正確なX線ビームサイズの相関を可能にする。 SEMから確実に回収し、低温で維持できる試料は、後でX線回折実験に使用することができます。これが不可能な場合は、これらのサンプルを廃棄します。注: グリッド全体と個々のマイクロクリスタルの両方をイメージングする際(それぞれ約 x45 倍と x700 倍)、同じパラメータを使用して用意したグリッドを使用してビームラインに進むか、またはステップ 3 で調整が必要なパラメータがあるかどうかを評価する必要があります。グリッドは、ステップ 5.5 で説明したテストを満たす必要があります。グリッドがこれらの基準を満たしていない場合は、ステップ 5 を繰り返す前に、ステップ 3 の間にさらに最適化が必要になります。 6. VMXmで回折実験用グリッドを準備する 液体窒素を使用して、サンプルローダーを大きな泡デュワー(図4B)でサンプルカートリッジに積み込んだVMXmサンプルホルダー(図4A)(最大5)を冷却してください。液体窒素レベルは、サンプルローダー上のサンプル位置のすぐ上にあるべきです。 サークリップとツールを準備します。 クリッピングツール、鉗子、VMXmサンプル鉗子などのツールをサンプルローダーの穴に入れ、冷却します。それは、デュワーの上にスポットライトを配置するのに役立ちます。 マイクロクリスタルにロードされたグリッドを含むグリッドボックスをサンプルローダーのグリッドボックスの凹部に素早く移し、蓋を緩めて回転可能にします(取り外さない)。 液体窒素の下で大きな鉗子でサンプルカートリッジから蓋を取り出し、サンプルローダーの下に置きます。 VMXm サンプル鉗子を使用してサンプルホルダーをサンプルローダーに持ち上げ、ホルダーがグリッドを受け入れられるように上向きであることを確認します。正しい位置に入ると、サンプルローダーの小さなピンがサンプルホルダーの中央にある小さな穴にかかわってきます。 冷却された細かい鉗子で、グリッドボックスから慎重にグリッドを持ち上げ、サンプルホルダーのグリッド開口部に近づけます。グリッドを平らに配置するように回転させます(サポートフィルム側がどちらの方向に向いているかは関係ありません)。 フォースを緩やかに下げて、グリッドがグリッド開口部の上にできるだけ近くになるように (グリッドを曲げないように注意して)、グリッドを開口部に放します。グリッドが正しく取り付けられていない場合は、細かい鉗子を慎重に使用してグリッドを位置に微調整するか、より大きな鉗子でサンプルホルダーを軽くタップします。 グリッド開口部のグリッド上に冷却されたサークリップツールを素早く配置し、ボタンを押してサークリップを取り付けます。ボタンの2つのくぼみの適用は、サークリップが正しく取り付けられていることを確認するのに役立ちます。 液体窒素を上に上げて、レベルがサンプルホルダーの上に約1.5cmになるようにします。VMXm サンプル鉗子を使用して、サンプルローダーの小さなピンの上に慎重に持ち上げ、サンプルカートリッジに戻します。サンプルカートリッジのサンプルホルダーの位置番号をメモします。 すべてのサンプルがロードされるまで、サンプルホルダにグリッドをロードし続けます。 サンプルが内部に残っている場合は、グリッドボックスをストレージデュワーに戻し、より多くのスペースを作成するためにデュワーからサンプルローダーを取り外します。 カートリッジのカートリッジ蓋を交換し、カートリッジの上部にあるピンが蓋の穴に固定されていることを確認します。 冷却し、液体窒素でVMXmエアロックデュワーを充填し、ロードされたサンプルカートリッジを含む泡のデュワーの隣に置きます。 VMXmカートリッジツールを使用して、カートリッジの側面にあるリッジに慎重にツールを取り付け、カートリッジをエアロックのデュワーに素早く持ち上げます。 液体窒素レベルがカートリッジを覆っていることを確認します。 エアロックデュワーに蓋を置き、ロードされたサンプルカートリッジでVMXmのエンドステーションに進みます。メモ:サンプルカートリッジをVMXmのエンドステーションにロードする場合は、ビームラインスタッフが行います。