Adaptações específicas de miose de ensaios de motilidade baseados em microscopia de fluorescência in vitro

Miosinas são proteínas motoras que exercem força em filamentos de actina usando a energia derivada da hidrolise da adenosina triphosfato (ATP)¹. Myosins contêm um domínio de cabeça, pescoço e cauda. O domínio principal contém a região de ligação de actina, bem como o local de vinculação ATP e hidrólise. Os domínios do pescoço são compostos por motivos de QI, que se ligam a correntes de luz, calmodulin, ou proteínas semelhantes à calmodulina^2,3. A região da cauda possui várias funções específicas para cada classe de miosinas, incluindo, mas não se limitando à dimerização de duas cadeias pesadas, ligação de moléculas de carga e regulação da minosina através de interações autoinibitórias com os domínios da cabeça¹.

As propriedades motile da minosina variam muito entre as classes. Algumas dessas propriedades incluem a razão de serviço (a fração do ciclo mecânico da miosina em que a minoina é obrigada a atuar) e a processividade (a capacidade de um motor de fazer vários passos em sua pista antes do desprendimento)⁴. As mais de 40 classes de miosinas foram determinadas com base nas análises sequenciais^5,6,7,8. As minons classe 2 são classificadas como “convencionais” já que foram as primeiras a serem estudadas; todas as outras classes de miosinas são, portanto, classificadas como “não convencionais”.

Myosin 5a (M5a) é uma minosina classe 5 e é um motor processivo, o que significa que pode dar vários passos ao longo de actin antes de dissociar. Possui uma alta relação de dever, indicando que passa grande parte de seu ciclo mecânico vinculado a atuar em^{9,10,11,12,13,14}. Em comum com outras miosinas, a cadeia pesada contém um domínio motor n-terminal que inclui tanto um actin-binding quanto um sítio de hidrólise ATP seguido por uma região do pescoço que serve como um braço de alavanca, com seis motivos de QI que se ligam a cadeias de luz essenciais (ELC) e calmodulin (CaM)¹⁵. A região da cauda contém bobinas enroladas α helicoidais, que escurecem a molécula, seguidas de uma região de cauda globular para carga de ligação. Sua cinética reflete seu envolvimento no transporte de melanócitos em melanócitos e do ântico endoplasmático nos neurônios Purkinje^16,17. M5a é considerado o motor prototípico de transporte de carga¹⁸.

As miosinas classe 2, ou as miosinas convencionais, incluem as miosinas que alimentam a contração do músculo esquelético, cardíaco e liso, além das isoformas de minosina não muscular 2 (NM2), NM2a, 2b e 2c¹⁹. Os isoformes NM2 são encontrados no citoplasma de todas as células e têm papéis compartilhados em citocina, adesão, morfogênese tecidual e migração celular^19,20,21,22. Este artigo discute protocolos convencionais de minosina no contexto da minosina não-muscle 2b (NM2b)²³. NM2b, em comparação com M5a, tem uma baixa taxa de imposto e é enzimaticamente mais lento com um V_máximo de 0,2 s^-123 em comparação com o V_máximo de M5a de ≈18 s^-124. Notavelmente, construções TN2b truncadas com duas cabeças não se movem prontamente processivamente em actin; em vez disso, cada encontro com actina resulta em um golpe de força seguido de dissociação da molécula²⁵.

O NM2b contém duas correntes pesadas de miosina, cada uma com um domínio de cabeça globular, um braço de alavanca (com um ELC e uma cadeia leve regulatória (RLC)), e um domínio de barra de bobina/cauda de bobina α helicoidal, aproximadamente 1.100 aminoácidos de comprimento, que escurece essas duas cadeias pesadas. A atividade enzimática e o estado estrutural do NM2b são regulados pela fosforilação da RLC²³. NM2b não fosforylated, na presença de FORÇAS Iônicas ATP e fisiológicas (aproximadamente 150 mM de sal), adota uma conformação compacta em que as duas cabeças participam de uma interação assimétrica e a cauda dobra sobre as cabeças em dois lugares²³. Neste estado, a minosina não interage fortemente com a actina e tem atividade enzimática muito baixa. Após a fosforilação RLC por quinase da cadeia de luz da miosina dependente da calmodulina (MLCK) ou quinase proteica associada a Rho, a molécula se estende e se associa a outras micosinas através da região da cauda para formar filamentos bipolares de aproximadamente 30 moléculas de minosina²³. A fosforilação acima mencionada do RLC também leva ao aumento da atividade ATPase ativada por actina de NM2b em aproximadamente quatro^{vezes 26,27,28}. Este arranjo de filamento bipolar, com muitos motores de miose em cada extremidade, é otimizado para papéis na manutenção de contração e tensão, onde os filamentos actin com polaridades opostas podem ser movidos em relação uns aos outros^23,29. Assim, o NM2b tem se mostrado um conjunto de motores ao interagir com actin. O grande número de motores dentro deste filamento permite que os filamentos NM2b se movam processivamente em filamentos de actina, tornando possível a processividade de filamento in vitro para caracterizar²⁹.

Embora tenha sido feito progresso na compreensão do papel das miosinas na célula, há a necessidade de entender suas características individuais no nível da proteína. Para entender as interações de actomiosina a um simples nível de interação proteína-proteína, em vez de dentro de uma célula, podemos expressar e purificar miosinas recombinantes para uso em estudos in vitro. Os resultados de tais estudos então informam os mecanobiologistas sobre as propriedades biofísicas de miosinas específicas que acabam por conduzir processos celulares complexos^{12,13,14,25,29}. Normalmente, isso é realizado adicionando uma etiqueta de afinidade a uma construção de minosina truncada ou de comprimento completo e purificando através da cromatografia de afinidade^29,30,31. Além disso, a construção pode ser projetada para incluir um fluorohore geneticamente encoável ou uma etiqueta para rotulagem de proteínas com um fluoróforo sintético. Adicionando tal rótulo fluorescente, estudos de imagem de molécula única podem ser realizados para observar a mecânica da miosina e cinética.

Após a purificação, a minosina pode ser caracterizada de várias maneiras. A atividade atpase pode ser medida por métodos colorimétricos, fornecendo insights sobre o consumo global de energia e a afinidade ativa do motor em diferentes condições³². Para aprender sobre a mecanoquímica de sua motilidade, mais experimentos são necessários. Este artigo detalha dois métodos à base de microscopia de fluorescência in vitro que podem ser usados para caracterizar as propriedades motil de uma proteína de minosina purificada.

O primeiro desses métodos é o ensaio de filamento de actina deslizante, que pode ser usado para estudar quantitativamente as propriedades do conjunto de motores de miosina, bem como estudar qualitativamente a qualidade de um lote de proteína purificada³³. Embora este artigo discuta o uso de microscopia de fluorescência interna total (TIRF) para este ensaio, esses experimentos podem ser efetivamente realizados usando um microscópio de fluorescência de campo amplo equipado com uma câmera digital, comumente encontrado em muitos laboratórios³⁴. Neste ensaio, uma camada saturada de motores de miosina é anexada a um deslizamento de tampa. Isso pode ser realizado usando nitrocelulose, anticorpos, membranas, superfícies derivadas_{sio 2}(como trimetilcloosilano), entre outros^{29,33,35,36,37,38}. Filamentos de actina fluorescentemente rotulados são passados através da câmara de deslizamento de cobertura, sobre a qual a actina se liga à mosina anexada à superfície. Após a adição de ATP (e quinases no estudo de NM2), a câmara é imageada para observar a translocação de filamentos de actina pelas miosinas ligadas à superfície. O software de rastreamento pode ser usado para correlacionar a velocidade e o comprimento de cada filamento de actin de deslizamento. O software de análise também pode fornecer uma medida do número de filamentos de actin móveis e estacionários, o que pode ser útil para determinar a qualidade de uma determinada preparação de mosina. A proporção de filamentos parados também pode ser intencionalmente modulada por amarração superficial de actina a outras proteínas e medida para determinar a dependência de carga da minoina³⁹. Como cada filamento de actina pode ser impulsionado por um grande número de motores disponíveis, este ensaio é muito reprodutível, com a velocidade medida final sendo robusta para perturbações como alterações na concentração inicial de mosina ou a presença de fatores adicionais na solução. Isso significa que pode ser facilmente modificado para estudar a atividade da mosina em diferentes condições, como fosforilação alterada, temperatura, força iônica, viscosidade da solução e os efeitos da carga induzida por amarras superficiais. Embora fatores como “cabeças mortas” de miose de ligação forte incapazes de hidrolise ATP possam causar filamentos de actin paralisados, existem múltiplos métodos para mitigar tais problemas e permitir medições precisas. As propriedades cinéticas da miosina variam muito entre as classes e, dependendo da miosina específica utilizada, a velocidade do planto de filamento actin neste ensaio pode variar de menos de 20 nm/s (miosina 9)^40,41, e até 60.000 nm/s(myosin characeano 11)⁴².

O segundo ensaio inverte a geometria do ensaio de filamento de planagem^{actin 12}. Aqui, os filamentos de actina são anexados à superfície do deslizamento de cobertura e o movimento de moléculas únicas de M5a ou de filamentos bipolares individuais de NM2b são visualizados. Este ensaio pode ser usado para quantificar os comprimentos de execução e velocidades de moléculas de miosina únicas ou filamentos em actina. Uma mancha de cobertura é revestida com um composto químico que bloqueia a ligação não específica e funcionaliza simultaneamente a superfície, como biotina-polietileno glicol (biotina-PEG). A adição de derivados de avidin modificados, em seguida, primes a superfície e actina biotinilada é passada através da câmara, resultando em uma camada de F-actin firmemente amarrado ao fundo da câmara. Finalmente, a minosina ativada e fluorescente (tipicamente 1-100 nM) é fluída através da câmara, que é então imagem para observar o movimento da mosina sobre os filamentos estacionários de actina.

Essas modalidades representam métodos rápidos e reprodutíveis que podem ser empregados para examinar a dinâmica tanto das miosinas não musculares quanto das miosinas musculares. Este relatório descreve os procedimentos para purificar e caracterizar tanto m5a quanto NM2b, representando miosinas não convencionais e convencionais, respectivamente. Isso é seguido por uma discussão de algumas das adaptações específicas da minosina, que podem ser realizadas para alcançar uma captura bem sucedida de movimento nos dois tipos do ensaio.

Expressão e biologia molecular
O cDNA para a minosina de interesse deve ser clonado em um vetor pFastBac1 modificado que codifica para uma tag BANDEIRA de terminal C (DYKDDDDK) se expressando M5a-HMM, ou uma tag BANDEIRA N-terminal se expressar a molécula de comprimento completo de NM2b^{23,43,44,45,46}. As tags FLAG do terminal C no NM2b resultam em uma afinidade enfraquecida da proteína para a coluna de afinidade bandeira. Em contraste, a proteína marcada por BANDEIRA N geralmente se liga bem à coluna de afinidade BANDEIRA²³. A proteína marcada n-terminalmente retém atividade enzimática, atividade mecânica e regulação dependente de fosforilação²³.

Neste artigo, foi utilizado um rato truncado M5a heavy meromyosin (HMM) com um GFP entre a tag FLAG e o C-terminus da cadeia pesada de miosina. Observe que, ao contrário do NM2b, o M5a-HMM pode ser marcado e purificado com sucesso com as tags FLAG N ou C-terminal e, em ambos os casos, a construção resultante estará ativa. A cadeia pesada M5a foi truncada no aminoácido 1090 e contém um linker de três aminoácidos (GCG) entre o GFP e a região da bobina enrolada do M5a⁴⁷. Nenhum linker adicional foi adicionado entre o GFP e o FLAG-tag. M5a-HMM foi co-expressado com calmodulin. A construção humana nM2b foi co-expressa com ELC e RLC. O N-termini do RLC foi fundido com um GFP através de um linker de cinco aminoácidos (SGLRS). Diretamente anexado à tag FLAG era um HaloTag. Entre o HaloTag e o N-terminus da cadeia pesada de minosina havia um linker feito de dois aminoácidos (AS).

Ambas as preparações de minosina foram purificadas a partir de um litro de cultura celular Sf9 infectada com baculovírus a uma densidade de aproximadamente 2 x 10⁶ células/mL. Os volumes do baculovírus para cada subunidade dependiam da multiplicidade de infecção do vírus, conforme determinado pelas instruções do fabricante. No caso do M5a, as células foram co-infectadas com dois baculovírus diferentes- um para calmodulin, e um para cadeia pesada M5A. No caso do NM2b, as células foram co-infectadas com três vírus diferentes- um para ELC, um para RLC e um para cadeia pesada NM2b. Para laboratórios que trabalham com uma diversidade de miose (ou outras proteínas multi-complexas), essa abordagem é eficiente, pois permite muitas combinações de cadeias pesadas e leves e cadeias leves comumente usadas, como a calmodulina, podem ser co-transfetadas com muitas cadeias pesadas de micosina diferentes. Todo o trabalho celular foi concluído em um armário de biossegurança com técnica estéril adequada para evitar contaminação.

Para a expressão de M5a e NM2b, as células Sf9 que produzem as miosinas recombinantes foram coletadas de 2 a 3 dias após a infecção, via centrifugação, e armazenadas a -80 °C. As pelotas celulares foram obtidas pela centrifugação das células Sf9 co-infectadas a 4 °C por 30 min a 2.800 x g. O processo de purificação de proteínas é detalhado abaixo.