התאמות ספציפיות מיוסין של במבחנה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה מבוססות ישבן

מיוסינוס הם חלבונים מוטוריים המפעילים כוח על חוטי אקטין באמצעות האנרגיה המופקת מאדנוסין טריפוספט (ATP) הידרוליזה¹. מיוסין מכילים תחום ראש, צוואר וזנב. התחום הראשי מכיל את אזור איגוד actin, כמו גם את האתר של כריכת ATP הידרוליזה. תחומי הצוואר מורכבים מוטיבים IQ, אשר נקשרים שרשראות אור, calmodulin, או חלבונים דמויי calmodulin^2,3. לאזור הזנב יש מספר פונקציות ספציפיות לכל סוג של מיוסין, כולל אך לא רק עמעום של שתי שרשראות כבדות, כריכה של מולקולות מטען, ורגולציה של המיוסין באמצעות אינטראקציות autoinhibitory עם תחומי הראש¹.

המאפיינים הרוטאליים של מיוסין משתנים מאוד בין השיעורים. חלק ממאפיינים אלה כוללים יחס חובה (השבר של המחזור המכני של מיוסין שבו myosin מחויב לפעול) ועיבוד (היכולת של מנוע לעשות צעדים מרובים על המסלול שלה לפני ניתוק)⁴. מעל 40 הכיתות של מיוסין נקבעו על סמך ניתוחי^{רצף 5,6,7,8}. מיוסין בכיתה 2 מסווגים “קונבנציונאלי” מאז הם היו הראשונים ללמוד; כל המעמדות האחרים של המיוסין מסווגים, אם כן, כ”לא שגרתיים”.

מיוסין 5a (M5a) הוא מיוסין בכיתה 5 והוא מנוע תהליכי, כלומר הוא יכול לקחת צעדים מרובים לאורך actin לפני ניתוק. יש לו יחס חובה גבוה, המציין כי הוא מבלה חלק גדול מהמחזור המכני שלו מחויב לפעול^{9,10,11,12,13,14}. במשותף עם מיוזינים אחרים, השרשרת הכבדה מכילה תחום מנוע N-terminal הכולל הן אקטין מחייב ואתר הידרוליזה ATP ואחריו אזור צוואר המשמש זרוע ידית, עם שישה מוטיבים IQ להיקשר שרשראות אור חיוניות (ELC) ו calmodulin (CaM)¹⁵. אזור הזנב מכיל סלילים מסלילים α-סליליים סליליים, אשר עמעמים את המולקולה, ואחריו אזור זנב כדורי למטען מחייב. הקינטיקה שלה משקפת את מעורבותה בהובלת מלנוזומים במלנוציטים ובריטיקולום אנדופלסמי בנוירונים פורקיניה^16,17. M5a נחשב מנוע הובלת מטענים טיפוסי¹⁸.

מיוזינים מסוג 2, או מיוזינים קונבנציונליים, כוללים את המאוזינים המעצימים התכווצות של שלד, לב ושריר חלק בנוסף לאיזוסין לא-מומסקל 2 (NM2) איזופורמים, NM2a, 2b ו- 2c¹⁹. איזופורמים NM2 נמצאים ציטופלסמה של כל התאים ויש להם תפקידים משותפים ציטוקינזה, הידבקות, מורפוגנזה רקמות, ונדידת תאים^19,20,21,22. מאמר זה דן פרוטוקולי מיוסין קונבנציונליים בהקשר של מיוסין לא 1000 (NM2b)²³. NM2b, בהשוואה ל- M5a, יש יחס חובה נמוך והוא איטי יותר אנזימטית עם_{V מקסימום} של 0.2 s^-123 לעומת_{V max} של M5a של ≈18 s^-124. ראוי לציין, מבנים NM2b חתוכים עם שני ראשים אינם נעים בקלות על actin; במקום זאת, כל מפגש עם actin תוצאות שבץ כוח ואחריו דיסוציאציה של המולקולה²⁵.

NM2b מכיל שתי שרשראות כבדות מיוסין, כל אחת עם דומיין ראש כדורי אחד, זרוע ידית אחת (עם ELC אחד ושרשרת אור רגולטורית אחת (RLC)), וגזע מוט סליל סליל / זנב סליל α סלילי, באורך של כ -1,100 חומצות אמינו, המבליט את שתי השרשראות הכבדות הללו. הפעילות אנזימטית ומצב מבני של NM2b מוסדרים על ידי זרחן של RLC²³. NM2b לא מפוזר, בנוכחות ATP וכוחות יוניים פיזיולוגיים (כ 150 מ”מ מלח), מאמץ קונפורמציה קומפקטית שבה שני הראשים להשתתף באינטראקציה אסימטרית והזנב מתקפל בחזרה מעל הראשים בשני מקומות²³. במצב זה, myosin אינו אינטראקציה חזקה עם actin ויש לו פעילות אנזימטית נמוכה מאוד. על זרחן RLC על ידי קטיעת שרשרת אור מיוסין תלוי מיוסין (MLCK) או קינאז חלבון הקשורים לרו, המולקולה משתרעת ומתחברת למיוזינים אחרים דרך אזור הזנב כדי ליצור חוטים דו קוטביים של כ -30 מולקולות מיוסין²³. הזרחן הנ”ל של RLC מוביל גם לפעילות ATPase מוגברת המופעלת על ידי actin של NM2b על ידי כארבע פעמים^26,27,28. סידור חוט דו קוטבי זה, הכולל מנועי מיוסין רבים בכל קצה, מותאם לתפקידים בתחזוקת התכווצות ומתח, שם ניתן להזיז חוטי אקטין עם קוטביות מנוגדת ביחס זה לזה^23,29. בהתאם, NM2b הוכח לפעול כהרכב של מנועים בעת אינטראקציה עם actin. המספר הגדול של מנועים בתוך חוט זה מאפשרים חוטי NM2b לנוע באופן תהליכי על חוטי actin, מה שהופך את עיבוד חוטי הפריה ישון אפשרי לאפיין²⁹.

בעוד התקדמות נעשתה בהבנת התפקיד של מיוסין בתא, יש צורך להבין את המאפיינים האישיים שלהם ברמת החלבון. כדי להבין אינטראקציות actomyosin ברמת אינטראקציה חלבון-חלבון פשוט, ולא בתוך תא, אנו יכולים לבטא ולטהר מיוסין רקומביננטי לשימוש במחקרים במבחנה. התוצאות של מחקרים כאלה אז ליידע mechanobiologists על המאפיינים הביופיסיים של מיוסין ספציפי כי בסופו של דבר לנהוג תהליכים תאיים מורכבים^{12,13,14,25,29}. בדרך כלל, זה מושג על ידי הוספת תג זיקה למבנה מיוסין באורך מלא או חתוך וטיהור באמצעות כרומטוגרפיה^{זיקה 29,30,31}. בנוסף, ניתן להנדס את המבנה כך שיכלול פלואורופור שניתן להקפיץ גנטית או תג לתיוג חלבונים עם פלואורופור סינתטי. על ידי הוספת תווית פלואורסצנטית כזו, ניתן לבצע מחקרי הדמיה של מולקולה אחת כדי להתבונן במכניקת מיוסין וקינטיקה.

לאחר הטיהור, המיוסין יכול להיות מאופיין במספר דרכים. פעילות ATPase יכולה להימדד בשיטות צבעוניות, המספקות תובנה לגבי צריכת האנרגיה הכוללת וזיקה לפעולה של המנוע בתנאים שונים³². כדי ללמוד על המכנוכימיה של תנועתיותה, נדרשים ניסויים נוספים. מאמר זה מפרט שתי שיטות מבוססות מיקרוסקופיה במבחנה, שניתן להשתמש בהן כדי לאפיין את המאפיינים הססנים של חלבון מיוסין מטוהר.

הראשון של שיטות אלה הוא בדיקת חוט אקטן הזזה, אשר ניתן להשתמש בו כדי ללמוד כמותית את תכונות ההרכב של מנועי מיוסין, כמו גם ללמוד באופן איכותי את האיכות של אצווה של חלבון מטוהר³³. למרות מאמר זה דן בשימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF) לבדיקה זו, ניסויים אלה יכולים להתבצע ביעילות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה המצויד במצלמה דיגיטלית, שנמצאת בדרך כלל במעבדות רבות³⁴. בבחינה זו, שכבה רוויה של מנועי מיוסין מחוברת לכיסוי. זה יכול להתבצע באמצעות ניטרוצלולוז, נוגדנים, ממברנות, SiO₂– משטחים נגזרים (כגון trimethylchlorosilane), בין היתר^{29,33,35,36,37,38}. חוטי אקטין המסומנים בפלואורסצנטית מועברים דרך תא כיסויי השער, שעליו האקטין נקשר למיוסיפן המחובר לפני השטח. עם תוספת של ATP (וקינאזים בחקר NM2), התא הוא התמונה כדי לצפות טרנסלוקציה של חוטי actin על ידי מיוזינים כבול פני השטח. תוכנת מעקב יכולה לשמש כדי לתאם את המהירות והאורך של כל חוט אקטאין הזזה. תוכנת ניתוח יכולה גם לספק מידה של מספר חוטי actin נעים ונייחים, אשר יכול להיות שימושי כדי לקבוע את האיכות של הכנת מיוסין נתון. חלקם של חוטים תקועים יכול גם להיות מווסת בכוונה על ידי קשירת פני השטח של actin חלבונים אחרים ונמדד כדי לקבוע את התלות בעומס של מיוסין³⁹. מכיוון שכל חוט אקטין יכול להיות מונע על ידי מספר רב של מנועים זמינים, בדיקה זו ניתנת לשחזור רב, כאשר המהירות הנמדדת הסופית חזקה להסתבכויות כגון שינויים בריכוז המיוסין ההתחלתי או נוכחות של גורמים נוספים בפתרון. משמעות הדבר היא שניתן לשנות אותו בקלות כדי ללמוד פעילות מיוסין בתנאים שונים, כגון זרחן שונה, טמפרטורה, כוח יוני, צמיגות פתרון, ואת ההשפעות של עומס המושרה על ידי צמיגי פני השטח. למרות גורמים כגון מיוסין חזק מחייב “ראשים מתים” מסוגל הידרוליזה ATP יכול לגרום חוטי actin תקוע, שיטות מרובות קיימות כדי למתן בעיות כאלה ולאפשר מדידות מדויקות. המאפיינים הקינטיים של מיוסין משתנים מאוד בין הכיתות, ובהתאם למיוסין הספציפי המשמש, מהירות גלישת חוטי האקטין בבדיקה זו יכולה להשתנות מתחת ל-20 ננומטר/שניה (מיוסין 9)^40,41,ועד 60,000 ננומטר/שניה(Characean myosin 11)^42.

הבחינה השנייה הפוך את הגיאומטריה של חוט ההזזה¹². כאן, חוטי actin מחוברים משטח כיסוי ואת התנועה של מולקולות בודדות של M5a או של חוטים דו קוטביים בודדים של NM2b הם חזותיים. בדיקה זו יכולה לשמש כדי לכמת את אורכי הריצה והמהירויות של מולקולות מיוסין יחיד או חוטים על actin. כיסוי מצופה בתרכובת כימית שחוסמת כריכה לא ספציפית ובמקביל מתפקדת את פני השטח, כגון ביוטין-פוליאתילן גליקול (ביוטין-PEG). התוספת של נגזרות אבידין מותאמות לאחר מכן ראשוניים את פני השטח ו actin biotinylated מועבר דרך התא, וכתוצאה מכך שכבה של F-actin קשור ביציבות לתחתית התא. לבסוף, מופעל ופלואורסצנטית שכותרתו מיוסין (בדרך כלל 1-100 ננומטר) זורם דרך התא, אשר לאחר מכן הוא התמונה להתבונן תנועת מיוסין מעל חוטי actin נייח.

שיטות אלה מייצגות שיטות מהירות וניתן לשחזור שניתן להשתמש בהן כדי לבחון את הדינמיקה של מיוסין לא-נואזמי ושרירים כאחד. דו”ח זה מתאר את הנהלים לטהר ולאפיין הן M5a והן NM2b, המייצגים מיוסין לא קונבנציונאלי וקונבנציונלי, בהתאמה. לאחר מכן דיון על כמה עיבודים ספציפיים myosin, אשר ניתן לבצע כדי להשיג לכידה מוצלחת של תנועה בשני סוגי הבחינה.

ביטוי וביולוגיה מולקולרית
יש לשכפל את ה- cDNA עבור המיוסין של העניין בווקטור pFastBac1 שונה המקודד עבור תג דגל מסוף C (DYKDDDDDK) אם הוא מבטא M5a-HMM, או תג דגל N-terminal אם הוא מבטא את המולקולה באורך מלא של NM2b^{23,43,44,45,46}. תגי דגל מסוף C ב- NM2b גורמים לזיקה מוחלשת של החלבון לעמודת זיקת הדגל. לעומת זאת, החלבון המתויג על ידי דגל N בדרך כלל נקשר היטב לעמודת זיקת הדגל²³. החלבון המתויג ב- N-סופני שומר על פעילות אנזימטית, פעילות מכנית ותקנה תלוית זרחן²³.

במאמר זה, עכבר קטוע M5a כבד meromyosin (הממ) כמו מבנה עם GFP בין תג דגל ואת C-terminus של שרשרת כבד מיוסין שימש. שים לב שבניגוד ל- NM2b, ניתן לתייג ולטהר בהצלחה את M5a-HMM באמצעות תגי דגל N או C-terminal ובשני המקרים המבנה המתקבל יהיה פעיל. השרשרת הכבדה M5a נחתכה בחומצת אמינו 1090 ומכילה מקשר שלוש חומצות אמינו (GCG) בין GFP לאזור הסליל המפותל של M5a⁴⁷. לא נוסף מקשר נוסף בין ה- GFP לתג FLAG. M5a-HMM בא לידי ביטוי בקלמודולין. מבנה NM2b האנושי באורך מלא בא לידי ביטוי בשיתוף עם ELC ו- RLC. N-termini של RLC הותך עם GFP באמצעות מקשר של חמש חומצות אמינו (SGLRS). מצורף ישירות לתג הדגל היה HaloTag. בין HaloTag ואת N-טרמינל של שרשרת כבד מיוסין היה מקשר עשוי שתי חומצות אמינו (AS).

שתי תכשירי המיוסין טוהרו מליטר אחד של תרבית תאי Sf9 נגועים בבקולווירוס בצפיפות של כ 2 x 10⁶ תאים / מ”ל. נפחי הבאקולווירוס עבור כל תת-ארון היו תלויים בריבוי הזיהום של הנגיף כפי שנקבע בהוראות היצרן. במקרה של M5a, תאים נדבקו במשותף עם שני baculoviruses שונים – אחד עבור calmodulin, ואחד עבור שרשרת כבדה M5a. במקרה של NM2b, תאים נדבקו במשותף עם שלושה וירוסים שונים – אחד עבור ELC, אחד עבור RLC, ואחד עבור שרשרת כבדה NM2b. עבור מעבדות העובדות עם מגוון של מיוסין (או חלבונים רב-קומתיים אחרים), גישה זו יעילה שכן היא מאפשרת שילובים רבים של שרשראות כבדות וקלות ושרשראות אור נפוצות כגון calmodulin ניתן לבצע שיתוף פעולה עם שרשראות כבדות מיוסין רבות ושונות. כל עבודת התא הושלמה בארון בטיחות ביולוגית עם טכניקה סטרילית נכונה כדי למנוע זיהום.

עבור הביטוי של M5a ו- NM2b, תאי Sf9 המייצרים את המיוסינוסים רקומביננטיים נאספו 2-3 ימים לאחר ההדבקה, באמצעות צנטריפוגה, ואוחסנו ב -80 °C (80 °F). כדורי תאים הושגו על ידי צנטריפוגה של תאי Sf9 נגועים במשותף ב 4 °C (50 °F) במשך 30 דקות ב 2,800 x g. תהליך טיהור החלבון מפורט להלן.