Stima del contenuto cristallino di cellulosa della biomassa vegetale utilizzando il metodo Updegraff

La cellulosa è la componente portante primaria delle pareti cellulari, presente sia nelle pareti cellulari primarie che secondarie. La parete cellulare è una matrice extracellulare che circonda le cellule vegetali ed è composta principalmente da proteine di cellulosa, lignina, emicellulosa, pectina e matrice. Circa un terzo della biomassa vegetale è la cellulosa¹ e svolge ruoli significativi nella crescita e nello sviluppo delle piante fornendo forza, rigidità, velocità e direzione della crescita cellulare, mantenimento della forma cellulare e protezione dagli stressanti biotici e abiotici. La fibra di cotone contiene il 95% di contenuto di cellulosa^{2, mentre} gli alberi contengono dal 40% al 50% di cellulosa a seconda delle specie vegetali e dei tipi^{di organo 3}. La cellulosa è composta da unità ripetute di cellobiosio, un disaccaride di residui di glucosio collegato da β-1,4 legami glicosidici⁴. L’etanolo cellulosico è prodotto dal glucosio derivato dalla cellulosa presente nelle pareti cellulari delle piante⁵. La fibra cellulosica è composta da diverse micro fibrille in cui ogni micro fibrillazione funge da nucleo con monomeri di glucosio 500-15000^1,6. L’omopolimero della cellulosa è sintetizzato da complessi di cellulosa sintasi incorporati nella membrana plasmatica (CSC)^1,7. Le singole proteine della cellulosa sintasi A (CESA) sintetizzano catene di glucano e le catene glucane adiacenti sono collegate da legami idrogeno per formare cellulosa cristallina^1,8. La cellulosa esiste in diverse forme cristalline con due forme predominanti, la cellulosa Iα e la cellulosa Iβ come forme native⁹. Nelle piante superiori, la cellulosa esiste in forma di cellulosa Iβ mentre la cellulosa vegetale inferiore esiste nella forma Iα^10,11. Nel complesso, la cellulosa svolge un ruolo significativo nell’impartire forza e rigidità alle pareti delle cellule vegetali.

I biocarburanti di prima generazione sono prodotti principalmente da amido di mais, zuccheri di canna e zuccheri di barbabietola, che sono fonti alimentari, mentre i biocarburanti di seconda generazione si concentrano sulla produzione di biocarburanti da materiale da parete a biomassa vegetale non^{alimentare 12}. Una stima accurata del contenuto cristallino di cellulosa è importante non solo per la ricerca fondamentale sulla biosintesi della cellulosa e sulla dinamica delle pareti cellulari, ma anche per la ricerca applicata sui biocarburanti e sui bio prodotti. Vari metodi sono stati sviluppati e ottimizzati per la stima della cellulosa nella biomassa vegetale, e il metodo Updegraff è il metodo più utilizzato per la stima della cellulosa. Il primo metodo riportato per la stima della cellulosa fu quello di Cross e Bevan nel 1908^13. Il metodo si basava sul principio della clorazione alternativa e dell’estrazione mediante solfato di sodio. Tuttavia, la cellulosa ottenuta con i protocolli originali e modificati del metodo Cross e Bevan ha mostrato la contaminazione di piccole frazioni di lignina oltre a una notevole quantità di xili e mannani¹⁴. Nonostante diverse modifiche per rimuovere la lignina e le emicellulosi dalla frazione di cellulosa, il metodo Cross-Bevan mantenne una notevole quantità di mannani insieme alla cellulosa. Successivamente, il metodo di Kurschner fu sviluppato impiegando acido nitrico ed etanolo per estrarre la cellulosa¹⁵. Questo metodo affermava che la lignina totale e il 75% dei pentosani erano stati rimossi, ma i veri risultati della cellulosa erano gli stessi stimati con il metodo di clorazione di Cross e Bevan. Un altro metodo (Norman e Jenkins) è stato sviluppato impiegando metanolo-benzene, solfato di sodio e ipoclorito di sodio per estrarre la cellulosa¹⁶. Questo metodo ha anche mantenuto una frazione di lignina (3%) e quantità significative di pentosani che portano a una stima accurata della cellulosa. Più tardi, Kiesel e Semiganowsky usarono un diverso approccio alla cellulosa idrolizzata usando l’80% di acido solforico concentrato, e gli zuccheri ridotti idrolizzati furono stimati con il metodo^{17 di}Bertrand. I due metodi, Waksman’s e Stevens¹⁸ e Salo¹⁴,^{19 che}sono stati sviluppati sulla base del metodo di Kiesel e Semiganowsky, hanno anche prodotto il 4-5% in meno di contenuto di cellulosa rispetto ai metodi^{precedenti 20}.

Il metodo Updegraff è il metodo più utilizzato per la stima del contenuto cristallino di cellulosa. Questo metodo è stato descritto per la prima volta da Updegraff per la misurazione della cellulosa nel 1969²¹. Il metodo Updegraff integra il metodo Kurschner (uso di acido nitrico), i metodi Kiesel e Seminowsky (idrolisi della cellulosa nei monomeri di glucosio usando acido solforico) con alcune modifiche, e il saggio di antronrone di Viles e Silverman per una semplice stima colorimetrica del contenuto di glucosio e cellulosa cristallina²². Il principio di questo metodo è l’uso di acido acetico e acido nitrico (reagente di Updegraff) per eliminare l’emicellulosa e la lignina dai tessuti vegetali omogeneizzati, che lascia cellulosa acetica / nitrica resistente all’acido per un’ulteriore^{lavorazione e stima 15}. La cellulosa acetica/nitrica resistente all’acido viene trattata con il 67% di acido solforico per rompere la cellulosa in monomeri di glucosio e i monomeri di glucosio rilasciati sono stimati per test di antronrone^21,23. Diverse modifiche del metodo Updegraff originale sono state utilizzate per semplificare la procedura e la stima della cellulosa mediante test di antronrone²⁴. In generale, questo metodo può essere suddiviso in cinque fasi. Nella prima fase, viene preparato il materiale vegetale. Nella seconda fase, la parete cellulare grezza è separata dalla biomassa totale, poiché la cellulosa è il componente chiave delle pareti cellulari delle piante. Più tardi, nella terza fase, la cellulosa viene separata dai componenti della parete cellulare non cellulosica trattando con reagente di Updegraff. Nella quarta fase, la cellulosa acetica/nitrica resistente all’acido viene suddivisa in monomeri di glucosio mediante trattamento con acido solforico. Il trattamento con acido solforico della cellulosa si traduce nella formazione di composti 5-idrossimetilfurfurali dalla reazione dei monomeri di glucosio con acido solforico. Infine, nell’ultima fase, l’antronrone genera un complesso blu verdastro bollendo con il composto furfurale generato nella fase^{precedente 25}. Questo metodo colorimetrico basato sull’antronrone fu usato per la prima volta nel 1942 da Dreywood. L’antronrone è un colorante che identifica composti furfurali di pentosio ed esosio disidratati come 5-idrossimetilfurfurolo, in condizioni acide. La reazione con esosio produce un colore intenso e una migliore risposta rispetto alle pentosi²⁵. La quantità di glucosio legato viene misurata dall’assorbanza dello spettrofotometro a 620 nm e l’intensità del complesso blu verdastro è direttamente proporzionale alla quantità di zucchero nel campione. I valori di assorbanza misurati sono stati confrontati con una linea di regressione della curva standard di glucosio per calcolare la concentrazione di glucosio del campione. Il contenuto misurato di glucosio è stato utilizzato per stimare il contenuto di cellulosa della biomassa vegetale.