Uppskattning av kristallin cellulosahalt i växtbiomassa med updegraff-metoden

Cellulosa är den primära bärande komponenten i cellväggar, som finns i både primära och sekundära cellväggar. Cellväggen är en extracellulär matris som omger växtceller och består främst av cellulosa, lignin, hemicellulosa, pektin och matrisproteiner. Ungefär en tredjedel av växternas biomassa är cellulosa¹ och den spelar en betydande roll i växttillväxt och utveckling genom att tillhandahålla styrka, styvhet, hastighet och riktning för celltillväxt, cellformsunderhåll och skydd mot biotiska och abiotiska stressfaktorer. Bomullsfiber innehåller 95% cellulosa² innehåll, medan träd innehåller 40% till 50% cellulosa beroende på växtart och organtyper³. Cellulosan består av upprepade enheter av cellobiose, en disackarid av glukosrester som är anslutna β-1,4 glykosidbindningar⁴. Cellulosaetanol framställs av glukosen som härrör från cellulosa som finns i växtcellsväggarna⁵. Cellulosafiber består av flera mikrofibriller där varje mikrofibril fungerar som kärnenhet med 500-15000 glukosmonomerer^1,6. Cellulosor homopolymer syntetiseras av plasmamembran inbäddade cellulosa syntas komplex (CSC)^1,7. Enskilda cellulosasyntas A-proteiner (CESA) syntetiserar glukankedjor och de intilliggande glukankedjorna är sammankopplade med vätebindningar för att bilda kristallin cellulosa^1,8. Cellulosa finns i flera kristallina former med två dominerande former, cellulosa Iα och cellulosa Iβ som inhemska former⁹. I högre växter finns cellulosa i cellulosa Iβ-form medan lägre växtcellulosa finns i Iα-form^10,11. Sammantaget spelar cellulosa en viktig roll för att ge styrka och styvhet till växtcellsväggarna.

Första generationens biobränslen produceras främst av majsstärkelse, sockerrör och sockerbetor, som är livsmedelskällor, medan andra generationens biobränslen fokuserar på biobränsleproduktion från biomassacellsmaterial från andra generationens biomassa som inte är livsmedelsväxter¹². Noggrann uppskattning av kristallint cellulosainnehåll är inte bara viktigt för grundforskningen om cellulosabiosyntes och cellväggsdynamik utan även för forskning om tillämpat biobränsle och bioprodukter. Olika metoder har utvecklats och optimerats för uppskattning av cellulosa i växtbiomassan, och Updegraff-metoden är den mest använda metoden för cellulosauppskattning. Den första rapporterade metoden för cellulosauppskattning var av Cross och Bevan 1908¹³. Metoden baserades på principen om alternativ klorering och extraktion genom natriumsulfat. Cellulosan som erhållits genom originalet samt modifierade protokoll av Cross och Bevan metoden visade dock förorening av små fraktioner av lignin utöver en betydande mängd xylans och mannans¹⁴. Trots flera modifieringar för att ta bort lignin och hemicelluloser från cellulosafraktionen behöll Cross-Bevan-metoden en betydande mängd mannaner tillsammans med cellulosa. Senare utvecklades Kurschners metod genom att använda salpetersyra och etanol för att extrahera cellulosa¹⁵. Denna metod uppgav att totalt lignin och 75% av pentosanerna avlägsnades men de verkliga cellulosaresultaten var desamma som de som uppskattades med kloreringsmetod för Cross och Bevan. En annan metod (Norman och Jenkins) utvecklades genom att använda metanol-bensen, natriumsulfat och natriumhypoklorit för att extrahera cellulosa¹⁶. Denna metod behöll också en bråkdel av lignin (3%) och betydande mängder pentosaner som leder till en korrekt uppskattning av cellulosa. Senare använde Kiesel och Semiganowsky ett annat tillvägagångssätt för hydrolyscellulosa med 80% koncentrerad svavelsyra, och de hydrolyserade reducerade sockerarter uppskattades med Bertrands metod¹⁷. De två metoderna, Waksmans och Stevens¹⁸ och Salo^14,19 som utvecklades baserat på Kiesel och Semiganowskys metod, gav också 4-5% mindre cellulosainnehåll jämfört med tidigare metoder²⁰.

Updegraff-metoden är den mest använda metoden för uppskattning av kristallint cellulosainnehåll. Denna metod beskrevs först av Updegraff för mätning av cellulosa 1969²¹. Updegraff-metoden integrerar Kurschner-metoden (användning av salpetersyra), Kiesel- och Seminowsky-metoder (hydrolys av cellulosa i glukosmonomerer med svavelsyra) med vissa modifieringar och antropisk analys av viles och silverman för enkel kolorimetrisk uppskattning av glukos och kristallin cellulosahalt²². Principen för denna metod är användningen av ättiksyra och salpetersyra (Updegraff reagens) för att eliminera hemicellulosa och lignin från de homogeniserade växtvävnaderna, vilket lämnar ättiksyrabeständig cellulosa för vidare bearbetning och uppskattning¹⁵. Den ättiksyraresistenta cellulosa behandlas med 67% svavelsyra för att bryta cellulosan i glukosmonomerer och de frigjorda glukosmonomererna uppskattas av anthrone assay^21,23. Flera ändringar av den ursprungliga Updegraff-metoden användes för att förenkla förfarandet och cellulosauppskattningen med anthrone-analys²⁴. I stort sett kan denna metod delas in i fem faser. I den första fasen bereds växtmaterialet. I den andra fasen separeras råcellväggen från den totala biomassan, eftersom cellulosa är den viktigaste komponenten i växtcellsväggar. Senare, i den tredje fasen, separeras cellulosan från de icke-cellulosa cellväggskomponenterna genom behandling med Updegraff reagens. I den fjärde fasen bryts den ättiksyraresistenta cellulosan till glukosmonomerer genom svavelsyrabehandling. Svavelsyrabehandling av cellulosa resulterar i bildandet av 5-hydroxymethylfurfural föreningar från reaktionen av glukosmonomererer med svavelsyra. Slutligen, i den sista fasen, genererar antronen ett grönblått komplex genom att koka med furfuralföreningen som genereras i föregående fas²⁵. Denna antropbaserade kolorimetriska metod användes första gången 1942 av Dreywood. Anthrone är ett färgämne som identifierar furfuralföreningar av pentos och hexose dehydrerade produkter såsom 5-hydroxymethylfurfural, under sura förhållanden. Reaktion med hexose ger en intensiv färg och bättre svar jämfört med pentoser²⁵. Mängden bundet glukos mäts med spektrofotometerabsorbans vid 620 nm och intensiteten hos det grönblå komplexet står i direkt proportion till mängden socker i provet. De uppmätta absorbansvärdena jämfördes med en glukosstandardkurva regressionslinje för att beräkna provet glukoskoncentration. Den uppmätta glukoshalten användes för att uppskatta cellulosahalten i växtbiomassan.