Schatting van het kristallijne cellulosegehalte van plantaardige biomassa met behulp van de Updegraff-methode

Cellulose is de primaire dragende component van celwanden, die aanwezig is in zowel primaire als secundaire celwanden. De celwand is een extracellulaire matrix die plantencellen omringt en bestaat voornamelijk uit cellulose, lignine, hemicellulose, pectine en matrixeiwitten. Ongeveer een derde van de biomassa van planten is cellulose¹ en het speelt een belangrijke rol in de groei en ontwikkeling van planten door kracht, stijfheid, snelheid en richting van celgroei, onderhoud van celvorm en bescherming tegen biotische en abiotische stressoren. Katoenvezel bevat 95% cellulose^2-gehalte, terwijl bomen 40% tot 50% cellulose bevatten, afhankelijk van de plantensoort en orgaantypen³. De cellulose bestaat uit herhalende eenheden cellobiose, een disaccharide van glucoseresiduen verbonden door β-1,4 glycosidische bindingen⁴. Cellulose-ethanol wordt geproduceerd uit de glucose die is afgeleid van de cellulose die aanwezig is in de plantencelwanden⁵. Cellulosevezel bestaat uit verschillende microfibrils waarin elke microfibril fungeert als kerneenheid met 500-15000 glucosemonomeren^1,6. Het cellulosehopolymeer wordt gesynthetiseerd door plasmamembraan ingebedde cellulosesynthasecomplexen (CSC’s)^1,7. Individuele cellulosesynthase A (CESA)-eiwitten synthetiseren glucanketens en de aangrenzende glucanketens worden door waterstofbindingen verbonden tot kristallijne cellulose^1,8. Cellulose bestaat in verschillende kristallijne vormen met twee overheersende vormen, cellulose Iα en cellulose Iβ als inheemse vormen⁹. In hogere installaties bestaat cellulose in cellulose Iβ-vorm, terwijl lagere plantaardige cellulose bestaat in Iα-vorm^10,11. Over het algemeen speelt de cellulose een belangrijke rol bij het overbrengen van sterkte en stijfheid aan de celwanden van de plant.

Biobrandstoffen van de eerste generatie worden voornamelijk geproduceerd uit maïszetmeel, rietsuikers en bietensuikers, die voedselbronnen zijn, terwijl biobrandstoffen van de tweede generatie zich richten op de productie van biobrandstoffen uit niet-voedsel plantaardig biomassacelwandmateriaal¹². Een nauwkeurige schatting van het kristallijne cellulosegehalte is niet alleen belangrijk voor fundamenteel onderzoek naar cellulosebiosynthese en celwanddynamiek, maar ook voor toegepast onderzoek naar biobrandstof en bioproducten. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld en geoptimaliseerd voor het schatten van cellulose in de biomassa van de installatie, en de Updegraff-methode is de meest gebruikte methode voor celluloseschatting. De eerste gerapporteerde methode voor de schatting van cellulose was door Cross en Bevan in 1908¹³. De methode was gebaseerd op het principe van alternatieve chlorering en extractie door natriumsulfaat. De cellulose verkregen door de oorspronkelijke en gewijzigde protocollen van de Cross- en Bevan-methode vertoonde echter verontreiniging van kleine fracties lignine naast een aanzienlijke hoeveelheid xylanen en mannans¹⁴. Ondanks verschillende modificaties om lignine en hemicelluloses uit de cellulosefractie te verwijderen, behield de Cross-Bevan-methode een aanzienlijke hoeveelheid mannans samen met cellulose. Later werd Kurschner’s methode ontwikkeld door salpeterzuur en ethanol te gebruiken om cellulose¹⁵te extraheren. Deze methode verklaarde dat de totale lignine en 75% van de pentosans werden verwijderd, maar de werkelijke celluloseresultaten waren dezelfde als die welke werden geschat met de chloreringsmethode van Cross en Bevan. Een andere methode (Norman en Jenkins) werd ontwikkeld door gebruik te maken van methanol-benzeen, natriumsulfaat en natriumhypochloriet om cellulose te extraheren¹⁶. Deze methode behield ook een fractie lignine (3%) en aanzienlijke hoeveelheden pentosans die leiden tot een nauwkeurige schatting van cellulose. Later gebruikten Kiesel en Semiganowsky een andere benadering van hydrolysecellulose met behulp van 80% geconcentreerd zwavelzuur, en de gehydrolyseerde gereduceerde suikers werden geschat door Bertrand’s methode¹⁷. De twee methoden, Waksman’s en Stevens¹⁸ en Salo^14,19 die werden ontwikkeld op basis van kiesel en Semiganowsky’s methode, leverden ook 4-5% minder cellulosegehalte op in vergelijking met eerdere methoden²⁰.

De Updegraff-methode is de meest gebruikte methode voor de schatting van het kristallijne cellulosegehalte. Deze methode werd voor het eerst beschreven door Updegraff voor de meting van cellulose in 1969²¹. De Updegraff-methode integreert de Kurschner-methode (gebruik van salpeterzuur), Kiesel- en Seminowsky-methoden (hydrolyse van cellulose in glucosemonomeren met behulp van zwavelzuur) met enkele wijzigingen, en de antroposinetest van Viles en Silverman voor een eenvoudige colorimetrische schatting van het glucose- en kristallijne cellulosegehalte²². Het principe van deze methode is het gebruik van azijnzuur en salpeterzuur (Updegraff-reagens) om hemicellulose en lignine uit de gehomogeniseerde plantenweefsels te verwijderen, waardoor azijnzuur/salpeterzuurresistente cellulose voor verdere verwerking en schatting¹⁵. De azijnzuur/salpeterzuurresistente cellulose wordt behandeld met 67% zwavelzuur om de cellulose in glucosemonomeren te breken en de vrijgekomen glucosemonomeren worden geschat door antroposofie^21,23. Verschillende wijzigingen van de oorspronkelijke Updegraff-methode werden gebruikt om de procedure en de celluloseraming te vereenvoudigen door antroposofie²⁴. In grote lijnen kan deze methode worden onderverdeeld in vijf fasen. In de eerste fase wordt het plantmateriaal bereid. In de tweede fase wordt de ruwe celwand gescheiden van de totale biomassa, omdat cellulose het belangrijkste onderdeel is van plantencelwanden. Later, in de derde fase, wordt de cellulose gescheiden van de niet-cellulosecelwandcomponenten door behandeling met Updegraff-reagens. In de vierde fase wordt de azijnzuur/salpeterzuurresistente cellulose door zwavelzuurbehandeling in glucosemonomeren afgebroken. Zwavelzuurbehandeling van cellulose resulteert in de vorming van 5-hydroxymethylfurfurale verbindingen uit de reactie van glucosemonomeren met zwavelzuur. Ten slotte genereert het anthrone in de laatste fase een groenblauw complex door te koken met de furfurale verbinding die in de vorige fase²⁵werd gegenereerd . Deze antroposofische colorimetrische methode werd voor het eerst gebruikt in 1942 door Dreywood. Anthrone is een kleurstof die furfurale verbindingen van pentose en hexose gedehydrateerde producten zoals 5-hydroxymethylfurfural identificeert, onder zure omstandigheden. Reactie met hexose produceert een intense kleur en een betere respons in vergelijking met pentoses²⁵. De hoeveelheid gebonden glucose wordt gemeten door spectrofotometerabsorptie bij 620 nm en de intensiteit van het groenblauwe complex is direct evenredig met de hoeveelheid suiker in het monster. De gemeten absorptiewaarden werden vergeleken met een glucosestandaard curveregressielijn om de glucoseconcentratie van het monster te berekenen. Het gemeten glucosegehalte werd gebruikt om het cellulosegehalte van de plantaardige biomassa te schatten.