Spot variation fluorescens korrelationsspektroskopi til analyse af molekylær diffusion ved plasmamembranen af levende celler

Kompleksiteten af plasmamembranorganisation
Den nuværende forståelse af cellemembranorganisation skal tage højde for flere aspekter¹. For det første varierer en kompleks lipidsammensætning ikke kun mellem celletyper, men også inden for en enkelt celle (membranorganeller / plasmamembran). Desuden er associerede eller iboende membranproteiner for det meste organiseret i dynamiske multimere komplekser, med store domæner, der strækker sig uden for membranen, og tegner sig for et betydeligt større område end transmembrandomænerne alene. Desuden udviser membranassocierede proteiner specifikke lipidbindende eller lipid-interagerende kapaciteter, der spiller roller i reguleringen af proteinfunktionen. Disse afhænger direkte af lipidernes lokale sammensætning og tilgængelighed².

Endelig observeres et signifikant niveau af asymmetri mellem to membranblade på grund af den iboende asymmetriske struktur af membranproteiner og fordelingen af lipider. Faktisk genererer en lipidmetabolsk balance mellem syntese og hydrolyse kombineret med lipid flip-flop mellem brochurerne en sådan asymmetrisk fordeling. Da enhver transport over dobbeltlaget er begrænset af den frie energi, der kræves for at flytte den polære hovedgruppe gennem membranernes hydrofobe indre, bistås den normalt af selektive transportører. For hver celletype har asymmetri tendens til at blive fastholdt. Alt i alt bidrager disse faktorer til lateral inhomogenitet eller ruminddeling af plasmamembranen ^3,4.

Vi beriger denne repræsentation af plasmamembranen ved at tage højde for den iboende molekylære diffusion i og på tværs af dobbeltlaget, hvilket bidrager til den dynamiske laterale heterogenitet på en skala fra tiendedele til hundreder af nanometer og mikrosekunder til sekunder. For eksempel bidrager lipidafhængige membrannanodomæner - de såkaldte lipidflåder, defineret som kolesterol, og sphingolipidrige signalplatforme - til ruminddelingen af plasmamembranen ^5,6. Imidlertid er den nuværende opfattelse af membranorganisation ikke begrænset til lipidflåder alene. Membran nanodomæner er mere komplekse og heterogene i sammensætning, oprindelse og funktion. Alligevel skal deres tilstedeværelse ved plasmamembranen koordineres tæt, og dynamiske interaktioner mellem proteiner og lipider synes at være vigtige i den rumlige fordeling og kemisk modifikation af membrannanodomæner 1,3,7,8.

SvFCS-princippet og dets anvendelse til at undersøge organiseringen af plasmamembranen
Selvom der er gjort store fremskridt i analysen af membrandomæner, hovedsageligt gennem biofysiske teknikker, skal de determinanter, der dikterer den lokale organisering af plasmamembranen, raffineres med passende rumlig og tidsmæssig opløsning. Determinanter baseret på sporing af individuelle molekyler giver fremragende rumlig præcision og tillader karakterisering af forskellige bevægelsesformer 9,10,11,12, men har en begrænset tidsmæssig opløsning med klassiske lave kamerabilledhastigheder og kræver mere eksperimentel indsats for at registrere et betydeligt antal baner. Alternativt kan diffusionskoefficienten for membrankomponenter evalueres ved Fluorescens Recovery After Photobleaching (FRAP)¹³ eller Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)¹⁴. Sidstnævnte har fået mere opmærksomhed, hovedsageligt på grund af dets høje følsomhed og selektivitet, mikroskopiske detektionsvolumen, lav invasivitet og brede dynamiske område¹⁵.

Det konceptuelle grundlag for FCS blev introduceret af Magde og kolleger for omkring 50 år siden^16,17. Det er baseret på registrering af udsving i fluorescensemission med en høj tidsmæssig opløsning (fra μs til s)¹⁸. I sin moderne version udføres målinger i levende celler af et lille konfokalt excitationsvolumen (~ 0,3 femtoliter) placeret inden for et område af interesse (f.eks. Ved plasmamembranen); fluorescenssignalet genereret ved diffuse fluorescerende molekyler, der går ind og ud af observationsvolumenet, opsamles med meget høj tidsmæssig opløsning (dvs. ankomsttidspunktet for hver foton på detektoren). Derefter beregnes signalet for at generere autokorrelationsfunktionen (ACF), hvorfra den gennemsnitlige tid t_d (diffusionstid), for hvilken et molekyle forbliver inden for brændvolumenet, ekstraheres sammen med det gennemsnitlige antal partikler (N), der er til stede i observationsvolumenet, hvilket er omvendt proportionalt med amplituden af ACF. Denne sidste parameter kan være nyttig information om molekylekoncentrationen inden for observationsvolumenet.

Siden da er et stigende antal FCS-modaliteter blevet implementeret takket være hurtigt udviklende instrumentering inden for biofotonik, hvilket gør det muligt at beskrive dynamiske fænomener, der forekommer i levende systemer. Alligevel ville en molekylær art opleve en mere overlappende fordeling af diffusionskoefficientværdierne, hvilket normalt afspejles af en uregelmæssig diffusionskarakteristik, hvor molekyler diffunderer med et ikke-lineært forhold i tid¹⁹ og vanskeligheder med at identificere den biologiske betydning af denne uregelmæssige subdiffusion. Tidligere er denne vanskelighed blevet noget overvundet ved at registrere den molekylære diffusion af FRAP fra områder af forskellig størrelse snarere end fra kun et område og derved give yderligere rumlig information. Dette muliggjorde for eksempel konceptualisering af membranmikrodomæner 20,21,22.

En oversættelse af denne strategi til FCS-målinger (dvs. den såkaldte spotvariation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS)) blev etableret ved at variere størrelsen af observationsens brændvolumen, hvilket gjorde det muligt at registrere fluktuationen i fluorescens på forskellige rumlige skalaer²³. SvFCS-tilgangen giver således indirekte rumlig information, der muliggør identifikation og bestemmelse af molekylære diffusionstilstande og type membranpartitionering (isolerede versus sammenhængende domæner²⁴) af studerede molekyler. Ved at plotte diffusionstiden t_d som en funktion af de forskellige rumlige skalaer defineret af taljeværdien (ω), som svarer til detektionsstråleradiusstørrelsen i dette tilfælde^23,25, kan man karakterisere diffusionsloven for et givet molekyle i en given fysiologisk tilstand. SvFCS er derfor en perfekt analog til enkeltpartikelsporing i tidsdomænet²⁶. Under den brownske diffusionsbegrænsning bør man forvente et strengt lineært forhold mellem diffusionstiden t_d og taljen ω (figur 1)^23,25. Oprindelsen af diffusionslovens afvigelse fra denne ordning kan tilskrives ikke-eksklusive årsager, såsom cytoskeletnet, molekylær trængsel, dynamisk partitionering i nanodomæner eller enhver kombination af disse og andre virkninger (figur 1) og skal testes eksperimentelt²⁵.

Her leverer vi alle nødvendige kontrolpunkter til daglig brug af et specialfremstillet svFCS optisk system bygget fra bunden, som supplerer vores tidligere protokolanmeldelser^27,28 på den eksperimentelle tilgang. Som et bevis på konceptet giver vi desuden retningslinjer for kalibrering af opsætningen, forberedelse af celler, dataindsamling og analyse til etablering af svFCS diffusionslov (DL) for Thy1-GFP, et plasmamembran glycosylphosphatidylinositolforankret protein, som vides at være lokaliseret i lipid-raft nanodomæner²⁹. Endelig demonstrerer vi, hvordan den delvise destabilisering af lipid-raft nanodomæner ved kolesteroloxidasebehandling påvirker diffusionsegenskaberne for Thy1-GFP. Derudover findes en detaljeret beskrivelse af opbygning af en svFCS-opsætning fra bunden i supplerende materiale.

1. Indstilling af specifikation til samling af en specialfremstillet svFCS-opsætning

BEMÆRK: Enkelheden i den foreslåede svFCS-opsætning muliggør nem installation, drift og vedligeholdelse til en lav pris, samtidig med at effektiviteten i fotongendannelse sikres. For flere detaljer, se Supplerende materiale.

1. Forsøgsrum og sikkerhed
   1. Installer systemet i et rum, der er stabiliseret ved ca. 21 °C.
   2. Undgå direkte luftstrøm på det passive (eller aktive) optiske bord, og følg lasersikkerhedsreglerne for optisk justering.
2. Hardware og software
   BEMÆRK: Supplerende materiale beskriver installationstrinnene vist i figur 2.
   1. Skriv den vigtigste anskaffelses- og styringssoftware i LabVIEW ved hjælp af en tilstandsmaskine- og begivenhedsstrukturarkitektur, hvor et multifunktionsopkøbskort driver de fleste controllere.
      BEMÆRK: Korrelatoren, laseren og effektmåleren styres eller overvåges af deres egen software.
   2. Tilpas hardware- og softwareinstallationsprocedurerne i henhold til den anvendte hardware.
3. Optisk opsætning
   BEMÆRK: Figur 3 illustrerer de optiske bænkmoduler, der anvendes i de følgende afsnit til at kontrollere kvaliteten af de optiske justeringer. Alle specifikationer for optiske elementer er angivet i tabellen over materialer. Proceduren for at opbygge opsætningen er meget detaljeret i Supplerende materiale. Dette system består af en kontinuerlig bølgelaser, et motoriseret omvendt mikroskop udstyret med et nedsænkningsvandsmål, en lavinefotodiodedetektor koblet til et enkelt fotontællingsmodul og en hardwarekorrelator. Et mikroskopinkubationskammer med vibrationsfrie varmeapparater er specielt designet til at styre temperaturen til eksperimenter på levende celler. Ved konvention svarer XY-aksen til den optiske stis vinkelrette plan, og Z-aksen svarer til den optiske sti.

2. Dagligt kontrolpunkt, før eksperimentet køres

1. Kontroller excitationsstien (figur 3, & ).
   1. Åbn alle irismembraner.
   2. Mål lasereffekten med effektmåleren, og hold den første iris helt åben.
   3. Drej halvbølgepladen (HWP) for at finde den maksimale effekt.
   4. Kontroller justeringen ved hjælp af iriserne, hvis lasereffekten er lavere end normalt, og flyt L1 og M1 skiftevis, hvis det er nødvendigt.
   5. Bemærk effektværdien i eksperimentlaboratorienotesbogen.
2. Kontroller registreringsstien (Figur 3, & ).
   1. Placer vandet, en dækslip og en dråbe af en 2 nM rhodamin 6G (Rh6G) opløsning på målet.
   2. Hvis fluorescenssignalet (tællenummer på APD'en, registreret med LabVIEW-softwaren) er lavere end normalt, skal du lave Rh6G-løsningen om, kontrollere placeringen og dækslipsens nummer på objektivlinsen eller fjerne eventuelle bobler.
      1. Hvis fluorescenssignalet stadig er lavere end normalt, skal du placere effektmåleren inde i den optiske sti for at blokere strålen.
      2. Sluk for APD (i det følgende henviser APD til APD og enkeltfotontællingsmodulet).
      3. Fjern prøven.
      4. Rengør og udskift objektivlinsen med et reflekterende mål.
      5. Kontroller laserstrålen på det reflekterende mål ved at fjerne effektmåleren fra lysbanen. Sørg for, at målets stråle er centreret, og at tilbagerefleksionen når den første iris på linjen (figur 3).
      6. Hvis ikke, skal du justere midterpositioneringen med M2 eller rygrefleksionen med det dikroiske spejl.
      7. Hvis mikroskopkoblingen er korrekt, skal du skubbe objektivlinsen tilbage, tilføje en dråbe vand, en dækslip og en dråbe af en mere koncentreret Rh6G-opløsning (dvs. 200 nM) og indstille en lavere lasereffekt end for de klassiske målinger (få μW).
      8. Tænd for APD og optimer APD- og pinhole-justering skiftevis med deres respektive XYZ-justeringsskruer, mens du overvåger intensitetssignalet (LabVIEW-software).
      9. Skift dækslip og tilføj en lavere koncentration af Rh6G (2 nM). Flyt pinhole langs Z-aksen for at finde en position, hvor det molekylære lysstyrkeforhold øges, og taljen er minimal.
      10. Luk iris, indtil signalet falder ned: laserstrålestørrelsen når målets bagblankestørrelse (dvs. den minimale taljestørrelse, se Supplerende materiale).
      11. Start korrelatorsoftwaren, og registrer data (se afsnit 7 for dataregistrering).
      12. Kontroller ACF, som skal vise en lav mængde støj, give en lille taljestørrelse og en høj tællehastighed pr. molekyle pr. Sekund (se afsnit 7 for dataanalyse og taljestørrelsesevaluering).

3. Generelle betragtninger vedrørende registrering og analyse af svFCS-data

1. Registrer og analyser fluorescensdata efter denne generelle ordning (se afsnit 7, 8 og 9): (1) fluorescensregistrering og ACF-generering (korrelatorsoftware), (2) uventet kassering af data, et gennemsnit af bevarede data, der passer til den relevante model (med hjemmelavet Igor Pro-software), (3) diffusionslovplot (hjemmelavet MATLAB-software 1) og (4) valgfri diffusionslovsammenligning (hjemmelavet MATLAB-software 2). De forskellige softwareprogrammer er tilgængelige efter anmodning.
   BEMÆRK: Hardwarekorrelatoren har en minimum samplingstid på 12,5 ns (dvs. en samplingfrekvens på 80 MHz). Det giver en tidsmæssig opløsning, der er mindst 1.000 lavere end den typiske residente tid for frit diffuserende lille molekyle i opløsning og 10⁶ mindre end diffusionstiden for membranproteiner inden for et konfokalt observationsvolumen.

4. Cellekultur og transfektion

1. Frø Cos7-cellerne i 8-brøndkammerdæksglas med # 1.0 borosilikatglasbund med en densitet på 10.000 celler / brønd ved hjælp af komplet Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 5% føtalt bovint serum, penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 U / ml) og L-glutamin (1 mM).
2. Cellerne dyrkes ved 37 °C i en befugtet atmosfære indeholdende 5 % CO₂ i 24 timer.
3. Fjern mediet, tilsæt 300 μL af det friske komplette dyrkningsmedium pr. brønd, og forinkuber cellerne i 30 minutter ved 37 °C.
4. 0,5 μg af plasmid-DNA'et, der koder for Thy-1-proteinet, fortyndes med eGFP²⁵ i 50 μL serumfri DMEM. Vortex kort at blande.
5. 1,5 μL DNA-transfektionsreagens fortyndes i 50 μL serumfrit DMEM, og opløsningen blandes godt.
6. Det fortyndede transfektionsreagens tilsættes direkte i den fremstillede DNA-opløsning, og forbindelserne blandes straks.
7. Inkuber den tilberedte blanding i 10 til 15 minutter ved stuetemperatur.
8. Der tilsættes 10 μL af de kombinerede DNA/transfektionsreagenskomplekser dråbevis på mediet i hver brønd, og homogeniseres ved forsigtigt at hvirvle pladen.
9. Cellerne inkuberes ved 37 °C med 5 % CO₂ i 3 timer.
10. Efter inkubationen erstattes det medium, der indeholder DNA/transfektionsreagenskomplekser, med 400 μL frisk komplet DMEM, og cellerne skal dyrkes i 16 timer før svFCS-eksperimentet.

5. Forberedelse af celler til svFCS-målinger

1. Fjern kulturmediet.
2. Cellerne vaskes forsigtigt to til tre gange med serumfri Hanks afbalanceret saltopløsning (HBSS) buffer indeholdende Ca²⁺ og Mg²⁺ suppleret med 10 mM (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsyre) (HEPES), pH 7,4 (HBSS/HEPES).
3. Vedligehold cellerne i HBSS/HEPES-bufferen under alle svFCS-anskaffelser.

6. Farmakologisk behandling

1. Kulturmediet fjernes, og cellerne vaskes to til tre gange med serumfri HBSS suppleret med 10 mM HEPES, pH 7,4 (HBSS/HEPES).
2. Cellerne inkuberes med 1 U/ml kolesteroloxidaseopløsning (COase) i HBSS/HEPES-buffer i 1 time ved 37 °C.
3. Opløsningen fjernes, og cellerne opretholdes i nærværelse af 0,1 U/ml COase i HBSS/HEPES-bufferen, mens svFCS-målingerne udføres.

7. Kalibrering af spotstørrelse

1. Forvarm mikroskopkammeret ved 37 °C.
2. Der fremstilles en standard 2 nM opløsning af Rh6G ved seriel fortynding.
3. Dråbe 200 μL 2 nM Rh6G-opløsning på en glasdæksler placeret på vandsænkningsmålet.
4. Start al hardware og software.
5. Mål og juster laserstråleeffekten på 488 nm til 300 μW. Afhængigt af lysstyrken og fotostabiliteten af den anvendte fluorescerende sonde skal du tilpasse denne effekt i henhold til (1) fluorescensintensiteten (på LabVIEW-softwaren), som skal være stabil, (2) ACF-formen (på korrelatorsoftwaren), som skal have en konstant form over tiden, og (3) tilpasningsparametrene, der giver en lille taljestørrelse og en høj tællehastighed pr. molekyle (fotoner pr. molekyle pr. sekund, typisk få titusinder til hundreder af fotoner pr. molekyle pr. Sekund).
   BEMÆRK: Amplituden af ACF (kaldet G (0)) er omvendt proportional med molekylets antal (dvs. koncentrationen af den fluorescerende sonde). Til kalibrering af taljestørrelse er dette en god kvalitetskontrolkandidatparameter. Derfor bør G(0) være ens for den samme koncentration fra dag til dag, da den forbinder taljestørrelsen og koncentrationen. For cellemålinger, da FCS er mere nøjagtig for lav koncentration, skal G (0) være høj for den korrekte parametertilpasningsekstraktion.
6. Indstil svFCS-belysnings-/detektionsmikroskopporten med LabVIEW-softwaren.
7. Tænd for APD.
8. Luk iris, indtil signalet falder ned for at opnå den minimale taljestørrelse, eller luk den for større taljestørrelse.
9. Optag flere ACF'er af valgt varighed (nemlig en kørsel) for at forbedre den statistiske reproducerbarhed, typisk 10 kørsler, der varer i 20 s hver med korrelatorsoftwaren.
10. Sluk for ADGANGSPUNKTET.
11. Brug Igor Pro-softwaren til at kontrollere og kassere kørslerne med stærke udsving på grund af molekylære aggregater. Udfør dette trin manuelt - det skal være brugeruafhængigt, efter at brugerne er blevet uddannet.
12. Tilpas gennemsnittet af de tilbageholdte ACF'er med en 3D-diffusionsmodel.
13. Uddrag fra tilpasningsparametrene den gennemsnitlige diffusionstid og gem den i en ".txt" -fil (filformatet dikteres af Igor Pro-softwaren).
14. Molekyle pr. sekund (en god præstationsindikator) kontrolleres ved at dividere den gennemsnitlige intensitet (ekstraheret fra fluorescenssporet) med antallet af molekyler (ekstraheret fra ACF).
    BEMÆRK: Sørg for, at denne værdi er høj og stabil fra dag til dag for de samme anskaffelsesparametre.
15. Kendskab til diffusionskoefficienten for Rh6G i vandig opløsning ved 37 ° C (D) og (se 7.13) beregnes den eksperimentelle taljestørrelse ω i henhold til: .
16. Anvend proceduren for hver taljestørrelsesændring, der kræves for at plotte FCS-diffusionsloven og før enhver ny eksperimentel serie af svFCS-dataindsamling.

8. svFCS dataindsamlinger på celler

1. Mål og juster stråleeffekten på 488 nm mellem 2 og 4 μW. Afhængigt af lysstyrken og fotostabiliteten af den anvendte fluorescerende sonde skal du tilpasse denne effekt for at tillade en høj tællehastighed pr. molekyle (typisk flere tusinde fotoner pr. molekyle pr. sekund), samtidig med at fotoblegningen holdes lav (dvs. et stabilt intensitetsspor på LabVIEW-softwaren).
2. Ækvilibreringsprøver i 10 minutter ved 37 °C, inden målingerne påbegyndes.
3. Indstil epi-fluorescensbelysningsmikroskopet med LabVIEW-softwaren.
4. Vælg en celle med en passende fluorescerende sondeplacering og (lav) fluorescenssignalintensitet.
   BEMÆRK: Jo lavere fluorescensen er, jo bedre er FCS-målingerne (se trin 8.1).
5. Indstil svFCS-belysnings-/detektionsmikroskopporten med LabVIEW-softwaren.
6. Tænd for APD.
7. Udfør en xy-scanning af den valgte celle med LabVIEW-softwaren.
8. Udfør en z-scanning, og find det konfokale sted ved den maksimale fluorescensintensitet ved at vælge plasmamembranen øverst og starte dataindsamlingen. For at maksimere adskillelsen mellem de to membraner skal du fortrinsvis udføre scanningen i cellens nukleare område.
9. Optag en serie på 20 kørsler, der varer i 5 s, hver med korrelatorsoftwaren.
   BEMÆRK: Sørg for, at varigheden af hver kørsel er lang nok til at opnå ACF'er med reduceret støj. Lange opkøb er modtagelige for fotobleaching eller uventede væsentlige variationer (f.eks. Aggregater). Tilpas antallet af kørsler, deres varighed og antallet af serier til prøverne, men sørg for, at de forbliver konstante inden for samme bulk af eksperimenter for reproducerbarhed.
10. Sluk for ADGANGSPUNKTET.
11. Kassér uventede kørsler med Igor Pro-softwaren.
12. Tilpas den gennemsnitlige ACF med en 2-arts 2D diffusionsmodel. Tilpas denne model til typen af diffusionsadfærd for målmolekylet.
13. Gem tilpasningsparametrene i den forrige fil (se trin 7.13).
14. Udfør 10 til 15 serier af optagelser på mindst 10 forskellige celler, og gengiv trin 8.3 til 8.13. Kontroller, at den opnåede enkeltfil indeholder taljestørrelsesoplysninger og tilpasningsparametrene for de 10-15 optagelser.
15. For at etablere en enkelt diffusionslov skal du analysere mindst fire taljestørrelser, der varierer mellem 200 og 400 nm. Dette interval er defineret af diffraktionsoptiske grænse, men er objektiv- (numerisk blænde) og laser (bølgelængde) afhængig.
    BEMÆRK: Da kalibreringen af taljestørrelsen ikke er absolut og har en vis grad af usikkerhed, blev en dedikeret MATLAB-software²⁸ , der tegner sig for x- og y-fejlen (nemlig ω² og t_d), bygget til at passe til diffusionsloven.
16. Start MATLAB-softwaren 1, og vælg en mappe, der indeholder alle ".txt" -filer svarende til mindst fire taljestørrelseseksperimenter.
17. Plot <t_d> versus <ω²>, nemlig diffusionsloven. To hovedparametre kan ekstraheres: y-akse-skæringspunktet (t₀) og den effektive diffusionskoefficient (D_eff, omvendt proportional med hældningen).

9. Diffusionslove af forskellige eksperimentelle tilstandssammenligninger

BEMÆRK: Om nødvendigt gengives afsnit 7 og 8 for forskellige forsøgsbetingelser. En dedikeret software (MATLAB software 2) blev udviklet for at afgøre, om disse diffusionslove er ens eller ej i henhold til t₀ - og D_{eff-værdierne} ²⁸. Det tester to hypoteser: de to værdier er forskellige, eller de to værdier er ikke forskellige ved en tærskel, der er fastsat over en sandsynlighed for falsk alarm (PFA). En vilkårlig PFA-værdi på 5% (T = 3,8) betragtes som den øvre signifikansgrænse mellem to parametre (t₀ eller D_eff), hvilket indikerer, at der kun er 5% chance for, at de to værdier er identiske.

1. Opret en ".xls"-fil, der indeholder de karakteristiske diffusionslovværdier for hver betingelse, der skal sammenlignes (dvs. en fil, der indeholder t₀, t_0-fejlen , D_eff - og D_eff-fejlen for de ikke-behandlede (NT) og behandlede (COase) betingelser som en tabel).
   1. Start MATLAB-softwaren 2.
   2. Vælg filen ".xls".
   3. Analyser det genererede farvekodede 2D-plot, hvor de statistiske test t₀ og D_eff skal afbildes på henholdsvis x- og y-akserne (figur 4). Jo højere T er, jo større er forskellen mellem de sammenlignede værdier.

10. Målinger af kolesterolkoncentration

1. Cellebehandling og lysis
   1. Frø Cos7-cellerne i tredobling i 6-brøndsplader ved 4 × 10⁵ celler / brønd og inkuber i 2 ml komplet DMEM ved 37 ° C med 5% CO₂ natten over for at give cellerne mulighed for at fastgøre til pladen.
   2. Fjern kulturmediet og vask cellerne tre gange med fosfatbufferet saltvand (PBS).
   3. Der tilsættes 1 ml HBSS/HEPES-buffer, der indeholder (eller ikke indeholder 1 U/ml coase, og der inkuberes i 1 time ved 37 °C med 5 % CO₂.
   4. Mediet erstattes med 1 ml HBSS/HEPES indeholdende 0,1 U/ml coase, og der inkuberes i 1 time ved 37 °C med 5 % CO₂.
   5. Fjern opløsningen og høst cellerne.
   6. Cellerne vaskes tre gange med PBS, og centrifugeres ved 400 × g i 5 min ved stuetemperatur.
   7. Lyse cellerne med radioimmunoprecipitation assay buffer (25 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP40, 10 mM,_MgCl2, 1 mM ethylendiamin tetraeddikesyre, 2% glycerol, protease og fosfatasehæmmer cocktail) i 30 minutter på is.
   8. Lysaterne centrifugeres ved 10000 × g i 10 minutter ved 4 °C, og supernatanten opsamles.
2. Kvantificer den samlede proteinkoncentration for hver prøve ved modificeret Bradfords proteinassay ved hjælp af arbejdsløsningen i henhold til producentens anbefalinger.
3. Måling af kolesterolkoncentration
   1. For at bestemme det samlede cellulære kolesterolniveau enzymatisk skal du bruge det relevante sæt (f.eks. Amplex Red Cholesterol Assay Kit) i henhold til producentens anbefalinger.
   2. For hver reaktion blandes prøven indeholdende 5 μg protein med Amplex Red reagens/peberrodsperoxidase/kolesteroloxidase/kolesterolesterase arbejdsløsning og inkuberes i 30 minutter ved 37 °C i mørke.
   3. Mål fluorescensen ved hjælp af excitering på 520 nm, og detekter emissionen ved 560-590 nm ved hjælp af en mikropladelæser.
   4. Træk baggrunden fra den endelige værdi, og bestem kolesterolkoncentrationen ved hjælp af en standardkurve.
   5. Beregn det endelige kolesterolindhold i ng kolesterol pr. μg protein.

Vi genererede en DL for Thy1-GFP udtrykt i Cos-7 celler (figur 4, sorte firkanter). Diffusionsloven har en positiv t_0-værdi (19,47 ms ± 2 ms), hvilket indikerer, at Thy1-GFP er begrænset i nanodomænestrukturer i plasmamembranen. Kolesteroloxidasebehandlingen af cellerne, der udtrykker Thy1-GFP, resulterede i forskydningen af DL t_0-værdien til 7,36 ± 1,34 ms (figur 4, grå firkanter). Denne observation bekræfter, at arten af Thy1-GFP indeslutning afhænger af kolesterolindholdet og er forbundet med lipidflåde nanodomæner. Disse to diffusionslove viser sig at være forskellige i henhold til den ovenfor beskrevne statistiske test (se trin 9.1.3) med hensyn til t₀ - og D_eff-værdier . Derudover vurderede vi koncentrationen af totalt cellulært kolesterol i ikke-behandlede Cos-7-celler versus de celler, der blev behandlet med COase. Et lille, men signifikant fald i det samlede kolesterolindhold observeres ved COase-behandling (figur 5). Da dette enzym kun virker på kolesterolpuljen, der er tilgængelig ved plasmamembranens ydre folder, antager vi, at det observerede fald i kolesterol kun er forbundet med plasmamembranen og resulterer i destabilisering af lipidflåde nanodomæner.

Figur 1: Simuleret fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) diffusionslove etableret ved spotvariation FCS for forskellige former for membranorganisation. (Øverste paneler) Skematisk repræsentation af membranorganisation - (A) fri diffusion, (B) meshworkbarrierer og (C) fælde / domæneindeslutninger - med banen tegnet for et enkelt molekyle (rød). Blå cirkler angiver skæringspunktet mellem membranen og laserstrålen i taljen ω. (Nederste paneler) FCS diffusionslove repræsenteret ved at plotte diffusionstiden t_d som en funktion af den kvadrerede radius ω². Diffusionslovprojektion (grøn stiplet linje) opfanger tidsaksen ved (A) oprindelsen (t₀ = 0) i tilfælde af fri diffusion; B) i negativ akse (t₀ < 0), når der er maskebarrierer, eller (C) i minusakse (t₀ > 0), når der er fælder og domæner (lipidflåder). D er den laterale diffusionskoefficient for brownsk bevægelse; D_eff, den effektive diffusionskoefficient; D_mikro, den mikroskopiske diffusionskoefficient inde i maskefælderne; D_i, diffusionskoefficienten inden for domæner; D_ud, diffusionskoefficienten uden for domæner; L, størrelsen på siden af et firkantet domæne; og r_D, radius af et cirkulært domæne. Denne figur er blevet ændret fra He og Marguet⁶. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Skematisk visning af svFCS-hardwarekontrol. Computeren styrer alle enheder gennem forskellige kommunikationsprotokoller: seriel (mikroskop, ekstern lukker), USB (XYZ piezoelektrisk scene, korrelator) og PCI (erhvervelseskort). DAQ: dataindsamlingskort, APD: lavinefotodiode, SPCM: enkeltfotontællingsmodul, DO: digitalt output. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Skematisk visning af excitations- og emissionsoptiske stier i svFCS-opsætningen. SvFCS-opsætningen indeholder fire moduler: (1) outputtet fra en fiberet 488 nm laser kollimeres, (2) en kombination af en halvbølgeplade og polariserende strålesplitter indstiller den optiske effekt, (3) laserstrålen fokuseret på prøven efter at have rejst gennem et rørlinsefrit motoriseret mikroskop, og (4) fluorescensen detekteres gennem en konfokallignende detektionssti på en lavinefotodiode koblet til et enkelt fotontællingsmodul, som leverer et signal til en hardwarekorrelator. Enkelhed giver systemet dets følsomhed, robusthed og brugervenlighed (bredt kommenteret i supplerende materiale). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: SvFCS-diffusionslovene genereret fra diffusionsanalyse af Thy1-GFP udtrykt i Cos-7. svFCS diffusionslove af Cos-7 celler uden behandling (NT, sorte firkanter) og efter kolesteroloxidasebehandling (COase, grå cirkler). Indsættelsen i grafen repræsenterer statistisk test af en signifikant forskel mellem de to præsenterede svFCS-diffusionslove (ifølge Mailfert et ^al.28). Testværdien (T) skal være over den tærskel, der er fastsat til 3,8, når begge diffusionslove er forskellige. Jo højere det er, jo større er forskellen mellem diffusionslovene. Værdien af T er farvekodet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Sammenligning af totalt kolesterolindhold i Cos-7 celler. Cos-7 celler blev enten ikke-behandlet (NT) eller behandlet med 1 U / ml kolesteroloxidase (COase) i 1 time. Dataene repræsenterer et eksempel på et eksperiment i tre eksemplarer. En tosidet, uparret t-test blev brugt til at vurdere den statistiske forskel (α = 0,05). Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel over materialer: Listen over optiske elementer, der kræves til svFCS-opsætningen.

Supplerende materiale: Dette dokument beskriver opbygningen af en svFCS-opsætning fra bunden. Klik her for at downloade denne fil.

Her har vi beskrevet implementeringen af svFCS-modulet på et standard fluorescerende mikroskop, en kraftfuld eksperimentel tilgang til at dechiffrere dynamikken i plasmamembranorganisationen i levende celler takket være FCS-diffusionslovanalysen. Konceptuelt er svFCS baseret på et simpelt princip: korrelationsmålinger af fluorescens i tidsdomænet, mens størrelsen af belysningsområdet varierer²³. Denne strategi har været medvirkende til at udlede nanoskopisk information fra mikroskopiske målinger, hvilket hjælper med at dechiffrere de vigtigste fysisk-kemiske elementer, der bidrager til plasmamembranorganisationen i steady state²⁵ og fysiologiske processer 30,31,32,33. Alt i alt viser disse svFCS-analyser utvetydigt eksistensen af lipidafhængige nanodomæner i forskellige celletyper og deres direkte implikation i tuning af forskellige signalhændelser.

Inden for denne ramme er der nogle optiske aspekter, der skal overvejes, mens du bygger svFCS-opsætningen for at optimere fotonbudgettet og minimere optiske afvigelser. Derfor anbefaler vi at bruge et mikroskop, hvorfra rørlinsen kan fjernes, når svFCS-målingen udføres. Desuden spiller en enkelt iris en nøglerolle i svFCS-opsætningen: den ændrer strålestørrelsen ved målets bageste blænde og varierer dermed direkte den effektive taljestørrelse (dvs. det effektive excitationsvolumen). Bjælkediameteren skal passe til den objektive bage pupil for at opnå den mindste taljestørrelse³⁴. Denne mulighed, som hjælper med at indstille taljestørrelsen, sikrer optimering af fotonbudgettet og er let at implementere. Endelig anvendes et minimalt antal optiske dele langs lysstien; jo mindre komplekst systemet er, jo færre fotoner går tabt. Alle disse muligheder forbedrer robustheden af svFCS-eksperimenter betydeligt.

Med hensyn til selve protokollen skal et par kritiske trin overvejes. Det vigtigste er en passende justering af de optiske stier, der er afgørende for vellykkede svFCS-målinger (protokol, afsnit 2). Dette er let at kontrollere ved at analysere fluorescenssignalet fra en 2 nM Rh6G-opløsning, som skal være ~ 200 kHz under 300 μW laserbelysning. Alle iriser skal åbnes, og ACF'erne skal have en vigtig amplitude (typisk G0 ~ 1,5-2,0). Et andet kritisk punkt vedrører cellerne og deres forberedelse til svFCS-analyse (protokol, afsnit 4-8). Deres massefylde skal tilpasses, således at isolerede celler, der skal observeres, er tilgængelige til analyse. Ikke-klæbende celler skal immobiliseres på et kammerdækselglas ved anvendelse af poly-L-lysinopløsning. Fluorescenssignalet fra cellemærkning bør ikke være for stærkt, eller det vil resultere i meget flade ACF'er, der er vanskelige at passe, og tilpasningsparametrene er belastet med en vigtig fejl. Derudover gør ikke-homogen mærkning og fluorescensaggregater i celler svFCS-målingerne ekstremt vanskelige at fortolke. Endelig påvirker kolesteroloxidasebehandling cellelevedygtighed, og svFCS-analysen bør ikke overstige en time efter behandlingen. Det er også bedre at registrere fluorescensfluktuationerne fra den øvre plasmamembran, da den ikke er fastgjort til understøtningen, og der er ingen risiko for hindret diffusion af molekyler på grund af de fysiske interaktioner med understøtningen.

Der har været nok fremskridt i svFCS-teknikken til dens anvendelse i forskellige tilgange på grund af mangfoldigheden af modaliteter til justering af detektionsvolumenet, hvilket gør det muligt at studere forskellige biologiske processer i levende celler. Et alternativ til at justere størrelsen på excitationsvolumenet er at bruge en variabel stråleudvidelse³⁵. Det er også muligt blot at modulere størrelsen af belysningsområdet ved at registrere det fluorescerende signal fra skæringspunktet af plasmamembranen langs z-retningen³⁶. Dette kan gøres på et standard konfokalt mikroskop, for hvilket der er udviklet en teoretisk ramme for at udlede diffusionsloven^37,38.

Selvom svFCS-metoden tilbyder spatio-temporal opløsning, hvilket er nødvendigt for karakteriseringen af plasmamembranens inhomogene laterale organisation, udelukker de geometriske indeslutningsformer ikke hinanden. En afvigelse på t₀ i den ene eller den anden retning afslører udelukkende en dominerende indeslutningsmåde²⁵. Desuden skyldes en anden vigtig begrænsning af den nuværende svFCS-metode den klassiske optiske diffraktionsgrænse (~ 200 nm). Dette er utvivlsomt større end de domæner, der begrænser molekylerne i celleplasmamembranen. Derfor udledes analysen af indespærringen af t_0-værdien , ekstrapoleret fra diffusionsloven.

Denne ulempe er blevet overvundet ved at implementere alternative metoder. Oprindeligt gav brugen af metalliske film boret med nanoaperturer mulighed for at belyse et meget lille membranområde (dvs. under den optiske diffraktionsgrænse for enkelte nanometriske åbninger af radier, der varierer mellem 75 og 250 nm)³⁹. Overgangsregimet forudsagt fra den teoretiske diffusionslov for isoleret domæneorganisation blev således rapporteret, og det tillod en forfining af den karakteristiske størrelse af de nanometriske membran heterogeniteter og et kvantitativt skøn over overfladearealet optaget af lipidafhængige nanodomæner³⁹. Alternativt er nanometrisk belysning også udviklet ved hjælp af nærfeltsscanning optisk mikroskopi⁴⁰ eller plane optiske nanoantennas⁴¹. For nylig har kombinationen af stimuleret emissionsudtømning (STED) og FCS givet et kraftfuldt og følsomt værktøj til at dokumentere diffusionsloven med meget høj rumlig opløsning. Denne STED-FCS giver adgang til molekylære diffusionsegenskaber på nanoskala, der forekommer inden for en kort periode, hvilket muliggør undersøgelsen af den dynamiske organisering af lipidprober ved plasmamembranen^42,43. Den ufuldstændige undertrykkelse af fluorescens i STED-processen udfordrer imidlertid analysen af autokorrelationskurverne i FCS.

En ny tilpasningsmodel er blevet udviklet for at overvinde denne vanskelighed og forbedre nøjagtigheden af diffusionstiderne og de gennemsnitlige molekyletalsmålinger⁴⁴. Endelig kan svFCS-princippet anvendes til langsom molekylær diffusion ved plasmamembranen på data registreret ved billedkorrelationsspektroskopi⁴⁵. For nylig er det blevet påvist, at kombination af atomkraftmikroskopi (AFM) med billeddannelse af total intern refleksion-FCS (ITIR-FCS) bidrager til forfining af arten af den mekanisme, der hindrer molekylær diffusion ved plasmamembranen, især nær perkolationstærskelmembrankonfigurationen på grund af en høj densitet af nanodomæner⁴⁶.

Afslutningsvis har etablering af diffusionslov af svFCS givet det eksperimentelle bevis for at udlede lokal heterogenitet skabt af dynamiske kollektive lipider og membranproteiners foreninger. Som anført af Wohland og kolleger⁴⁶, "FCS diffusion lov analyse forbliver et værdifuldt værktøj til at udlede strukturelle og organisatoriske træk under opløsningsgrænsen fra dynamisk information". Alligevel er vi nødt til at udvikle nye modeller for at forfine fortolkningen af diffusionsloven, der skal give mulighed for en bedre forståelse af dynamikken i de molekylære begivenheder, der forekommer ved plasmamembranen.