이 글에서는 절단면을 통해 전두께의 피부를 즉시 봉합하여 액솔로틀 사지 재생 동안 상처 표피 형성을 억제하는 수술 방법을 수행하는 방법을 설명한다. 이 방법을 통해 연구자들은 사지 재생의 초기 단계에서 상처 표피의 기능적 역할을 조사 할 수 있습니다.
지난 세기 동안 도롱뇽 재생 생물학의 고전 실험은 상처 표피가 절단 후 빠르게 형성되고 사지 재생에 필요한 중요한 신호 구조라는 것을 오랫동안 확립했습니다. 그러나 지난 수십 년 동안 분자 수준에서 정확한 기능을 연구하는 방법은 도롱뇽 모델 시스템에서 사용할 수있는 정확한 기능 기술과 게놈 정보가 부족하기 때문에 제한적이었습니다. 흥미롭게도, 다양한 도롱뇽 게놈의 방출과 CRISPR을 포함한 기능적 유전자 검사 방법의 출현과 결합 된 최근의 수많은 시퀀싱 기술은 전례없는 분자 분해능으로 이러한 기본 실험을 다시 방문 할 수있게합니다. 여기에서는 절단 직후 상처 표피 형성을 억제하기 위해 성체 액솔로틀에서 고전적으로 개발 된 전체 피부 플랩 (FSF) 수술을 수행하는 방법을 설명합니다. 상처 표피는 일반적으로 외부 환경으로부터 상처를 봉쇄하기 위해 절단면에 근접한 피부 내의 상피 세포의 원위 이동을 통해 형성됩니다. 수술은 상피 세포 이동 및 근본적인 손상된 중간엽 조직과의 접촉을 방해하기 위해 절단면을 통해 전체 두께의 피부 (표피 및 진피층 모두를 포함)를 즉시 봉합하는 것을 수반합니다. 성공적인 수술은 blastema 형성 및 사지 재생의 억제를 초래합니다. 이 수술 방법을 현대의 하류 분자 및 기능 분석과 결합함으로써 연구자들은 사지 재생 중 상처 표피 기능과 생물학의 분자 토대를 밝히기 시작할 수 있습니다.
Lazzaro Spallanzani가 17681 년에보고 한 이래로, 도롱뇽 사지 재생은 수세기 동안 생물 학자들을 매혹시킨 가장 잘 연구 된 자연 재생 현상 중 하나였습니다. 성공적인 사지 재생은 blastema로 알려진 미분화 된 세포 구조의 형성, 성장 및 후속 패터닝에 달려 있습니다. 연구자들은 blastema의 세포 조성뿐만 아니라 그 형성에 필요한 지원 조직 및 세포 유형을 이해하는 데 상당한 진전을 이루었습니다.2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . 그러나, 블라스템마 형성의 개시를 유도하는 상이한 조직과 세포 유형 사이의 조정된 신호전달 메카니즘은 여전히 잘 이해되지 않고 있다.
성공적인 블라스테마 형성 및 재생을위한 핵심 요구 사항은 절단 후 12 시간 이내에 절단면을 덮는 일시적이고 전문화 된 상피 인 상처 표피입니다10. 절단 후, 손상에 근접한 무손상 피부로부터의 상피 세포는 절단면을 통해 빠르게 이동하여 얇은 상처 상피를 형성한다14. 다음 주에 blastema가 형성됨에 따라, 초기 상처 표피는 정점 상피 캡 (AEC)15라고 불리는 두꺼운 상피 신호 전달 구조로 발전합니다. 정상적인 전체 두께의 피부는 기저 라미나로 분리 된 상피 및 진피 층을 모두 포함하지만 상처 표피 / AEC는 상피층으로 만 구성되어 있으며 기본 라미나가 부족합니다 16,17. 기저 라미나와 진피의 부재는 상처 상피 세포와 하부 조직 사이의 직접적인 접촉을 허용하며, 이는 블라스템마 형성 및 유지에 중요한 두 구획 사이의 양방향 신호 전달을 용이하게합니다17,18.
고전적인 실험 연구는 상처 표피 / AEC 기능과 필요성을 억제하여 그 형성을 억제함으로써 다양한 혁신적인 수술 방법을 고안했습니다. 이러한 방법에는 봉합19 또는 절단면을 통해 전두께 피부20,21을 접목하고, 절단된 사지를 체강 내로 즉시 봉합하고22, 초기 상처 표피 및 AEC23,24를 매일 지속적으로 제거 또는 조사하는 것이 포함되었다. 전체적으로, 이러한 실험은 상처 표피/AEC의 중요성을 확립했을 뿐만 아니라, 초기 조직 조직분해에서 그 역할을 더욱 결정했을 뿐만 아니라 재생 전반에 걸쳐 전구 세포 증식 및 모세포종 증식13을 유지하였다.
그러나, 이러한 이전의 연구들은 주로 조직학적 염색뿐만 아니라 세포 증식을 추적하기 위한 트리티미딘 펄스로 제한되었다. 사실, 도롱뇽의 현대 시퀀싱 기술 및 기능 기술로 이러한 고전적 실험을 재검토하는 것은 최근에야 이루어졌으며 재생 초기 단계에서 염증 및 ECM 분해 / 침착을 조절하는 상처 표피에 대한 추가 역할의 발견으로 이어졌습니다25. 다양한 도롱뇽 게놈 및 전사체 서열26,27,28,29,30,31,32,33,34뿐만 아니라 도롱뇽 종에서 이용 가능한 기능적 방법의 급증하는 수와 함께11,35,36,37,38 연구진은 이제 상처 표피 형성, 기능 및 AEC 개발을 주도하는 분자 메커니즘을 풀기 시작할 수있는 좋은 위치에 있습니다.
불행히도, 상처 표피 형성을 억제하기 위해 사용 된 이러한 고전적인 방법 중 일부는 기술적으로 도전적이며, 동일한 실험에서 생물학적 복제물 간의 재현성에 어려움을 겪고 있습니다. 예를 들어, 이식편이 결국 숙주 사지에서 떨어질 수 있고 상처 표피 / AEC를 매일 제거하는 것이 기본 조직을 손상시키지 않으면 어렵 기 때문에 피부 이식편을 유지하는 것이 어려울 수 있습니다. 또한, 절단 된 사지를 체강으로 봉합하는 것은 어렵고 삽입 부위에서 추가 부상이 필요합니다. 한편, 절단면 바로 위에 전체 두께의 피부를 봉합하는 것은 비교적 간단하고, 기술적으로 재현성이 있으며, 조직 손상을 최소화한다. 이 전체 피부 플랩 (FSF) 수술 방법은 이전에 1976 년 Anthony Mescher가 성인 뉴트 (Notophthalmus viridiscens)에서 개발했습니다. 그는 FSF 수술이 절단면을 통한 상피 세포 이동과 상피 세포와 기저 조직 간의 직접적인 접촉을 금지함으로써 상처 표피 형성 및 기능을 억제한다는 것을 입증했습니다.
여기서, 이러한 수술 절차는 axolotl 사지를 이용한 단계별 시술이다. 현대의 분자 및 시퀀싱 기술과 결합하여이 기술은 연구자가 사지 재생 중에 상처 표피 / AEC 형성 및 기능에 대한 이해를 깊게하는 데 매우 도움이 될 수 있습니다.
이 기사는 상처 표피 형성을 억제하기 위해 axolotl 팔다리에서 전체 피부 플랩 수술을 수행하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 수술은 상처 표피 형성을 억제하는 다른 방법에 비해 비교적 간단하고 기술적으로 재현 가능하지만 수술의 성공에 영향을 줄 수있는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 노출 된 기저 조직 위에 손상되지 않은 전체 피부 플랩을 당길 때, 전체 두께의 피부가 어떤 식 으로든 손상되지 않는 것이 가장 중요합니다. 피부 플랩의 손상은 여전히 작은 상처 표피의 형성으로 이어질 수 있으며, 이는 작은 blastema와 같은 파생을 초래할 수 있습니다. 둘째, 수술 후 치료 중에 봉합사가 빠지지 않도록하십시오.이 봉합사는 작은 상처 표피의 형성으로 이어질 수 있습니다. 이 시점까지, 봉합 된 사지와 모든 표면 사이의 잠재적 인 접촉을 최소화하는 것이 중요하며, 특히 수술 후 첫 주에 특히 중요합니다. 이를 예방하는 몇 가지 방법은 axolotl이 수술 후 이동할 수있는 충분한 공간을 갖출 수 있도록 충분히 큰 용기에 axolotl을 수용하고 마취시키는 것을 수반합니다.
이 수술에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 아마도 가장 주목할만한 것은 수술의 성공은 두 가지 방법으로 만 평가 될 수 있다는 것입니다 : 수술 첫 두 주 동안 해부 범위를 사용하여 상처 표피의 부재를 검색하거나 3 주 이내에 블라스테마가 형성되는지 여부를 확인하십시오. 이러한 방법은 효과적이지만 처리량이 상대적으로 낮습니다. 상처 표피 특이적 마커에 대한 미래의 트랜스제닉 리포터 axolotls의 개발은 성공적인 수술과 실패한 수술에 대한 신속한 스크리닝에 도움이 될 수 있습니다. 또한,이 수술은 손상되지 않은 피부가 더 약하기 때문에 어린 동물에게 수행하기가 더 어렵습니다. 따라서 성인 이하 또는 성인 axolotls를 사용하는 것이 좋습니다.
이 수술은 원래 N. viridiscens19에서 개발되었지만 axolotls25,39에 쉽게 적응할 수 있으며 다른 도롱뇽 종에도 적용될 수 있습니다. 요컨대,이 기술을 미래의 사지 재생 연구에 적용하면 연구자가 상처 표피 생물학을 다루는 더 많은 도구를 개발하고 블라스템마 형성을 시작하는 데 그 기능을 유도하는 기본 메커니즘을 식별 할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 Doug에게 끊임없는 격려와 확고한 지원에 감사 드리며, 멜튼 연구소 회원들은 원고에 대한 도움이되는 피드백과 의견을 보내 주셔서 감사합니다. 저자는 또한 하버드 동물 자원 사무소 (OAR)의 헌신적 인 동물 보호에 감사드립니다.
Curved spring scissors | Fine Scientific Tools | 15009-08 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | |
Forceps | Fine Scientific Tools | 11252-40 | Need two pairs |
Nylon monofilament sutures (9-0) | Roboz | SUT-1000-21 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Stereo microscope | Leica | MZ6 | |
Sulfamerazine sodium salt | Sigma-Aldrich | 127-58-2 | |
Surgical scissors | Fine Scientific Tools | 14002-14 |