アキソロトル四肢再生中のフルスキンフラップ手術による創傷表皮形成の阻害

すべての動物実験は、ハーバード大学のIACUC(プロトコル#:11-32)およびAAALACガイドラインに従って実施した。 1. 麻酔と回復のための解決策とセットアップの準備 麻酔のための新鮮な0.1%トリカイン溶液および回収のための0.5%スルファメラジンナトリウム塩溶液を調製する。関連する研究機関で承認されたIACUCプロトコルに従って、水を使用してアキソロトル飼育に適した溶液37 を作ります(例えば、ホルトフレターのソリューションを修正しました)。溶液がよく混合され、アクソロトル全体を沈めるのに十分な量が準備されていることを確認してください。 0.1%トリカイン溶液を調製するには、1gのトリカインおよび1gの炭酸水素ナトリウムを1Lの水と混合する。ソリューションは、このレシピに従ってスケールアップできます。 0.5%スルファメラジンナトリウム塩溶液を調製するには、スルファメラジンナトリウム塩5gを1Lの水と混合する。ソリューションは、このレシピに従ってスケールアップできます。スルファメラジン溶液は、外科的回復中の細菌感染を防止する抗生物質である。 Clidox-Sまたは70%エタノールで噴霧して手術領域を消毒する。手術器具(鉗子、解剖はさみ、スプリングはさみ)をオートクレーブで滅菌します。複数回の手術を行う場合は、動物同士の熱いビーズ滅菌器で手術器具を滅菌してください。 回収エリアを設定するには、15cmのペトリ皿またはアクソロトルに収まる容器を、湿った氷で満たされたバケツの上に置きます。ペトリ皿に低レベルの0.5%スルファメラジンナトリウム塩溶液を充填し、アキソロトルが完全に水没しないようにする。手術後の氷上での回復は、麻酔から目覚めている間、動物の動きを遅らせ、縫合された領域を比較的邪魔されずに治癒することを可能にする。注:この設定は、研究者が利用可能な材料に応じてカスタマイズできます。 2.フルスキンフラップ手術を行う アキソロトルを0.1%トリカイン溶液の容器に浸すことによって麻酔する。これには約15〜20分かかります。尾のピンチを行うことによって、軸索が実際に完全に麻酔されていることを確認してください。軸索からの応答がない場合は、手術を続行します.注:この手術には、古くて大きなアキソロトル(少なくとも15cmのサイズ)を使用してください。プラスチックピペットを使用してアキソロトル系水で定期的に皮膚を濡らすことにより、手術中、アキソロトルが十分に水分補給されたままであることを確認してください。手術前に滅菌PBSでその領域を灌漑することによって、手術部位を無菌的に準備するようにしてください。動物はまた、処置のために滅菌外科用ドレープの上に置かれるべきである。 解剖はさみを用いて、ゼウゴポディアル骨格要素の遠位端で四肢切断を行う(図1.1)。 スプリングハサミを使用して、皮膚の腹部に小さな切開(約2mm)を行います(図1.2)。 鉗子を使用して、皮膚をゼウゴポディアル骨格要素のほぼ正中線まで慎重に剥がし、基礎となる四肢組織(筋肉、骨など)を露出させる。(図 1.3)。皮膚を傷つけないようにしてください。ステップ 2.8 の後の注を参照してください。 外科用はさみを使用して、ゼウゴポッドの正中線で露出した下肢組織を切断する(図1.4)。 外科用ハサミで筋肉組織を押し戻し、露出した骨をトリミングします。注:これは、治癒の改善を確実にし、突き出た骨が縫合されたフラップに対してギザギザになり、後で無傷の皮膚フラップの完全性を混乱させる可能性があるため、手術の成功を高めるためにも必要です。 鉗子を使用して、余分な全厚皮膚を切断面上に慎重に引っ張り、露出した下層組織を覆い、腹側全厚皮膚と接続して縫合糸を所定の位置に収めます(図1.5)。 皮膚フラップの残りの左右を無傷の皮膚の腹側部分に縫合する。これは、フラップの側面を「十字」の方法で縫合するか(推奨)(図1.6-1.9)、または単に腹側皮膚にまっすぐに縫合することによって行うことができます。縫合には鉗子と湾曲したスプリングハサミを使用してください。露出した下層の組織が見えず、縫合糸がしっかりと結ばれていることを確認してください(少なくとも3回結び目があります)。注:手順2.4、2.7-2.8で無傷の皮膚が損傷していないことが重要です。我々は、全厚皮膚への損傷が、損傷領域がまだ小さな創傷表皮を形成する可能性があるため、失敗した手術と相関していることを見出した。可能であれば、全厚の皮膚フラップを手渡すときは、鈍い一対の鉗子を使用してみてください。 外科用はさみで中顎動物レベルで切断することにより、対側肢の切断(オプションの内部動物制御)を行う。外科用ハサミで筋肉組織を押し戻し、露出した骨をトリミングします。注:同じ動物におけるステップ4中の手術の成功をよりよく評価するために、内部対側肢制御を行うことができます。しかしながら、別の動物における同じ四肢の切断もまた、対照として役立つために使用され得る。 3. 術後の回復とケア 手術が完了したら、キムワイプまたは滅菌ペーパータオルを容器またはペトリ皿の底に置き、濡らします。動物をぬるま湯の上の容器に入れ、キムワイプまたはペーパータオルの露出した端を動物の上の周りに静かに包み込み、スルファメラジン溶液で十分に水分補給してください。麻酔からの回復中に最小限の動きを確実にするために、30分から1時間湿った氷の上に放置する。 動物を0.5%スルファメラジン溶液で静的な収容容器に入れる。Axolotlsは、感染を防ぐために最初の24時間この溶液に留まらなければなりません。 アキソロトルを通常のシステム水に入れ、毎日健康状態を監視します。縫合糸が毎日落ちないように注意してください、これは結果を混乱させる小さな創傷表皮の形成をもたらす可能性があるので。注:ハウジング容器に、アクソロトルが動き回るのに十分なスペースがあることを確認し、アクソロトルの縫合肢が容器の側面に接触する可能性を最小限に抑えてください。これは、縫合糸が所定の位置にとどまることを確実にするのに役立ちます, 特に手術後の最初の週に. 4. 実体顕微鏡による手術の成功評価 注:少なくとも週に1回は実体顕微鏡で動物をチェックし、皮膚全体のフラップの完全性と手術の成功を評価することをお勧めします。 ステップ2.1のように0.1%トリカインでアキソロトルを麻酔する。容器にアクソロトルが動き回るのに十分なスペースがあることを確認してください。 術後最初の2週間に検査する場合は、実体顕微鏡を使用して縫合された四肢を検査し、縫合糸が飛び出していないこと、および透明な薄い創傷表皮がどこにも見えないことを確認します。術後3週目以降に検査する場合は、芽球腫が形成されていないことを確認し、正常な対照切断された四肢(同じ動物または別の動物のいずれかから)が再生中にどのように進行したか(すなわち、芽球腫が形成されたかどうか)と比較する。 完了したら、アキソロトルを通常のシステムの水と飼育条件に戻します。