Summary

Un modello Xenotranest derivato dal paziente per la malformazione Venosa

Published: June 15, 2020
doi:

Summary

Presentiamo un protocollo dettagliato per generare un modello murine xenograft di malformazione venosa. Questo modello si basa sull’iniezione sottocutanea di cellule endoteliali derivate dal paziente contenenti mutazioni genetiche TIE2 e/o PIK3CA iper-attivanti. Le lesioni dello Xenotrapianto ricapitolano da vicino le caratteristiche istopatologiche del tessuto del paziente VM.

Abstract

La malformazione venosa (VM) è un’anomalia vascolare che deriva dallo sviluppo alterato della rete venosa con conseguente venatura dilatata e spesso disfunzionale. Lo scopo di questo articolo è quello di descrivere attentamente la creazione di un modello murine xenograft che imita vm umano ed è in grado di riflettere l’eterogeneità del paziente. Le mutazioni TEK (TIE2) e PIK3CA non ereditarie iper-attivanti nelle cellule endoteliali (EC) sono state identificate come i principali fattori di allargamento della nave patologica nella VM. Il seguente protocollo descrive l’isolamento, la purificazione e l’espansione della EC derivata dal paziente che esprime il TIE2 mutante e/o PIK3CA. Questi CE vengono iniettati sottocutaneamente nella parte posteriore dei topi atimici immunodeficienti per generare canali vascolari ectatici. Le lesioni generate con LA CE mutante TIE2 o PIK3CA sono visibilmente vascolarizzate entro 7-u20129 giorni dall’iniezione e ricapitolano le caratteristiche istopatologiche del tessuto del paziente vm. Questo modello di xenotrapianto VM fornisce una piattaforma affidabile per studiare i meccanismi cellulari e molecolari che guidano la formazione e l’espansione delle macchine virtuali. Inoltre, questo modello sarà strumentale per gli studi traslazionali che testano l’efficacia dei nuovi candidati ai farmaci per prevenire l’allargamento anormale delle navi visto nella VM umana.

Introduction

I difetti nello sviluppo della vascolatura sono la causa alla base di molte malattie, tra cui la malformazione venosa (VM). Vm è una malattia congenita caratterizzata da morfogenesi anormale ed espansione delle vene1. Importanti studi sul tessuto della macchina virtuale e sulle cellule endoteliali (EC) hanno identificato mutazioni di guadagno di funzione in due geni: TEK, che codifica il recettore della chinasi della tirosina TIE2, e PIK3CA, che codifica l’isoforma di p110 (sottounità catalitica) di PI3-chinasi (PI3K)2,3,4,5. Queste mutazioni somatiche si trasgrede in un’iperattivazione indipendente dal ligando delle vie di segnalazione chiave angiogenica/crescita, compreso il PI3K/AKT, con conseguente vene ectatiche dilatate3. Nonostante queste importanti scoperte genetiche, i successivi meccanismi cellulari e molecolari che innescano l’angiogenesi anormale e la formazione di canali vascolari allargati non sono ancora pienamente compresi.

Durante l’angiogenesi normale e patologica, i nuovi vasi provengono da una rete vascolare preesistente e la CE subisce una sequenza di importanti processi cellulari tra cui la proliferazione, la migrazione, il rimodellamento della matrice extracellulare (ECM) e la formazione del lume6. Le colture in vitro bidimensionali (2D/3D) della CE sono strumenti importanti per studiare ciascuna di queste proprietà cellulari singolarmente. Tuttavia, vi è una chiara richiesta di un modello murino che ricapitoli l’allargamento patologico delle navi all’interno del microambiente dell’ospite, fornendo al contempo una piattaforma efficiente per la valutazione preclinica di farmaci mirati per la ricerca traslazionale.

Fino ad oggi, non è stato segnalato un modello murino transgenico di VM associato a mutazioni di guadagno di funzione TIE2. Gli attuali modelli di topo VM transgenici si basano sull’espressione onnipresente o limitata ai tessuti della mutazione attiva PIK3CA p.H1047R3,5. Questi animali transgenici forniscono informazioni significative sugli effetti specifici di tutto il corpo o dei tessuti di questa mutazione hotspot PIK3CA. La limitazione di questi modelli è la formazione di una rete vascolare altamente patologica con conseguente precoce letalità. Pertanto, questi modelli murini non riflettono pienamente l’occorrenza sporadica di eventi mutazionali e la natura localizzata della patologia della macchina virtuale.

Al contrario, i modelli di xenotrapianto derivati dal paziente si basano sul trapianto o sull’iniezione di tessuto patologico o cellule derivate dai pazienti in topi immunodeficienti7. I modelli Xenotrapianto sono un potente strumento per ampliare le conoscenze sullo sviluppo della malattia e la scoperta di nuovi agentiterapeutici 8. Inoltre, l’utilizzo di cellule derivate dal paziente consente agli scienziati di ricapitolare l’eterogeneità della mutazione per studiare lo spettro dei fenotipi dei pazienti.

Qui, descriviamo un protocollo in cui la VM EC derivata dal paziente che esprime una forma mutante costitutivamente attiva di TIE2 e/o PIK3CA viene iniettata sottocutaneamente nella parte posteriore di topi nudi atimici. Le cellule vascolari iniettate sono sospese in un quadro ECM al fine di promuovere l’angiogenesi come descritto nei precedenti modelli di xenotrapianto vascolare9,10,11. Queste VM EC sono sottoposte a una significativa morfogenesi e generano vasi patologici allargati e perfuso in assenza di cellule di supporto. Il modello di xenotrapianto descritto di VM fornisce una piattaforma efficiente per la valutazione preclinica dei farmaci mirati per la loro capacità di inibire l’espansione incontrollato del lume.

Protocol

I campioni di tessuto del paziente sono stati ottenuti dai partecipanti dopo il consenso informato dalla raccolta e dal deposito di campioni di tessuti e dati da pazienti con tumori e anomalie vascolari nell’ambito di un Comitato di revisione istituzionale (IRB) approvato per le politiche istituzionali presso il Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (CCHMC), Cancer and Blood Disease Institute e con l’approvazione del Comitato per l’indagine clinica. Tutte le procedure relative agli animali descritte di seguito so…

Representative Results

Questo protocollo descrive il processo di generazione di un modello murine xenotrapianto di VM basato sull’iniezione sottocutanea della EC derivata dal paziente nella parte posteriore di topi nudi immunodeficienti. Le colonie di cellule endoteliali possono essere raccolte entro 4 settimane dall’isolamento iniziale delle cellule dal tessuto VM o dal sangue lesionale(Figura 1A,B). Il giorno dopo l’iniezione, la spina di lesione xenotrapianto copre una superficie di circa 80 u2012100 mm2. Nelle n…

Discussion

Qui viene descritto un metodo per generare un modello xenotrapianto derivato dal paziente della macchina virtuale. Questo modello murino presenta un eccellente sistema che consente ai ricercatori di ottenere una comprensione più profonda dell’allargamento del lume patologico e sarà determinante nello sviluppo di terapie più efficaci e mirate per il trattamento della VM. Questo può essere facilmente adattato per studiare altri tipi di anomalie vascolari come la malformazione venosa linfatica capillare<sup class="xref"…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano Nora Lakes per la correzione delle bozze. La ricerca riportata in questo manoscritto è stata supportata dal National Heart, Lung, and Blood Institute, sotto il premio numero R01 HL117952 (E.B.), parte del National Institutes of Health. Il contenuto è esclusivamente di competenza degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istituti Nazionali di Sanità.

Materials

Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males Envigo 069(nu)/070(nu/+) Subcutaneous injection
Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I) Vector Laboratories B-1065 Histological anlaysis
Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM) Thermo Fisher 974106 Cell culture
Bovine Serum Albumin (BSA) BSA A7906-50MG Cell culture; Histological analysis
Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O) Sigma C7902-500G Cell culture
Caliper Electron Microscopy Sciences 50996491 Lesion plug measurment
CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads) Life Technologies 11155D EC separation
Cell strainer (100 μM) Greiner 542000 Cell culture
Collagenase A Roche 10103578001 Cell culture
Conical Tube; polypropylene (15 mL) Greiner 07 000 241 Cell culture
Conical Tube; polypropylene (50 mL) Greiner 07 000 239 Cell culture
Coplin staining jar Ted Pella 21029 Histological anlaysis
Coverglass (50 X 22 mm) Fisher Scientific 12545E Histological anlaysis
DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB) Vector Laboratories SK-4105 Histological anlaysis
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) Corning 10-027-CV Cell culture
DynaMag-2 Life Technologies 12321D EC separation
Ear punch VWR 10806-286 Subcutaneous injection
EDTA (0.5M, pH 8.0) Life Technologies 15575-020 Histological anlaysis
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements) Lonza CC-3162 Cell culture
Eosin Y (alcohol-based) Thermo Scientific 71211 Histological anlaysis
Ethanol Decon Labs 2716 Histological anlaysis
Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone GE Healthcare SH30910.03 Cell culture
Filter tip 1,250 μL MidSci AV1250-H Multiple steps
Filter tip 20 μL VWR 10017-064 Multiple steps
Filter tip 200 μL VWR 10017-068 Multiple steps
Formalin buffered solution (10%) Sigma F04586 Lesion plug dissection
Hemacytometer (INCYTO; Disposable) SKC FILMS DHCN015 Cell culture
Hematoxylin Vector Hematoxylin H-3401 Histological anlaysis
Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL) Sigma FC010-10MG Cell culture
Hydrogen Peroxide solution (30% w/w) Sigma H1009 Histological anlaysis
ImageJ Software Analysis
Isoflurane, USP Akorn Animal Health 59399-106-01 Subcutaneous injection
magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) Sigma M1880-500G Cell culture
Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free) Corning 356237 Subcutaneous injection
Microcentrifuge tube (1.5 mL) VWR 87003-294 EC separation
Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm) Fisher Scientific 1255015-CS Histological anlaysis
Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles Becton Dickinson (BD) BD305115 Subcutaneous injection
Normal horse serum Vector Laboratories S-2000 Histological anlaysis
Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X) Corning 30-009-CI Cell culture
Permanent mounting medium (VectaMount) Vector Laboratories H-5000 Histological anlaysis
Pestle Size C, Plain Thomas Scientific 3431F55 EC isolation
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher Scientific BP3994 Cell culture
Scale VWR 65500-202 Subcutaneous injection
Serological pipettes (10 ml) VWR 89130-898 Cell culture
Serological pipettes (5ml) VWR 89130-896 Cell culture
Sodium carbonate (Na2CO3) Sigma 223530 Cell culture
Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC Vector Laboratories SA-5004 Cell culture
Syringe (60ml) BD Biosciences 309653 Cel culture
SYRINGE FILTER (0.2 µM) Corning 431219 Cell culture
Syringes (1 mL with Luer Lock) Becton Dickinson (BD) BD-309628 Subcutaneous injection
Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm) Greiner 664160 Cell culture
Tissue culture-treated plate (145X20 mm) Greiner 639160 Cell culture
Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm Eppendorf 30701119 Cell culture
Tris-base (Trizma base) Sigma T6066 Histological anlaysis
Trypan Blue Solution (0.4 %) Life Technologies 15250061 Cell culture
Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA) Corning 25-052-Cl Cell culture
Tween-20 Biorad 170-6531 Histological anlaysis
Wheaton bottle VWR 16159-798 Cell culture
Xylenes Fisher Scientific X3P-1GAL Histological anlaysis

Referencias

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Citar este artículo
Schrenk, S., Goines, J., Boscolo, E. A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation. J. Vis. Exp. (160), e61501, doi:10.3791/61501 (2020).

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