Un modèle xénogreffe dérivé par le patient pour la malformation veineuse
Summary
Nous présentons un protocole détaillé pour générer un modèle de xénogreffe murine de malformation veineuse. Ce modèle est basé sur l’injection sous-cutanée de cellules endothéliales dérivées du patient contenant des mutations du gène TIE2 hyper-activantes et/ou PIK3CA. Les lésions de Xenograft récapitulent étroitement les dispositifs histopathologiques du tissu patient de VM.
Abstract
La malformation veineuse (VM) est une anomalie vasculaire qui résulte d’une altération du développement du réseau veineux entraînant des veines dilatées et souvent dysfonctionnelles. Le but de cet article est de décrire soigneusement l’établissement d’un modèle de xénogreffe murine qui imite VM humaine et est capable de refléter l’hétérogénéité du patient. Les mutations TEK (TIE2) non héréditaires (somatiques) et PIK3CA dans les cellules endothéliales (EC) ont été identifiées comme les principaux moteurs de l’élargissement pathologique des vaisseaux dans la VM. Le protocole suivant décrit l’isolement, la purification et l’expansion des EC d’origine du patient exprimant le mutant TIE2 et/ou PIK3CA. Ces EC sont injectées sous-cutanéement dans le dos des souris athymiques immunodéficientes pour générer des canaux vasculaires ectatiques. Les lésions générées avec TIE2 ou PIK3CA-mutant EC sont visiblement vascularisées dans les 7\u20129 jours suivant l’injection et récapitulent les caractéristiques histopathologiques du tissu patient de VM. Ce modèle VM xenograft fournit une plate-forme fiable pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires conduisant la formation et l’expansion de VM. En outre, ce modèle sera instrumental pour des études translationnelles testant l’efficacité des nouveaux candidats de drogue dans la prévention de l’agrandissement anormal de navire vu dans VM humain.
Introduction
Les défauts dans le développement de la vascularisation sont la cause sous-jacente de nombreuses maladies, y compris la malformation veineuse (VM). VM est une maladie congénitale caractérisée par la morphogenèse anormale et l’expansion des veines1. Des études importantes sur les tissus VM et les cellules endothéliales (EC) ont identifié des mutations de gain de fonction dans deux gènes : TEK, qui code le récepteur de la tyrosine kinase TIE2, et PIK3CA, qui code l’isoforme p110α (sous-unité catalytique) de PI3-kinase (PI3K)2,3,4,5. Ces mutations somatiques entraînent une hyperactivation ligand-indépendante des voies de signalisation angiogéniques/de croissance clés, y compris PI3K/AKT, ce qui entraîne des veines ecstatiques dilatées3. Malgré ces découvertes génétiques importantes, les mécanismes cellulaires et moléculaires suivants déclenchant l’angiogenèse anormale et la formation de canaux vasculaires agrandis ne sont toujours pas entièrement compris.
Pendant l’angiogenèse normale et pathologique, de nouveaux vaisseaux germent d’un réseau vasculaire préexistant et EC subissent une séquence de processus cellulaires importants comprenant la prolifération, la migration, le remodelage de matrice extracellulaire (ECM) et la formation de lumen6. Les cultures in vitro bidimensionnelles (2D/3D) d’EC sont des outils importants pour étudier chacune de ces propriétés cellulaires individuellement. Néanmoins, il existe une demande claire pour un modèle de souris récapitulant l’élargissement pathologique des vaisseaux dans le microenvironnement hôte tout en fournissant une plate-forme efficace pour l’évaluation préclinique des médicaments ciblés pour la recherche translationnelle.
À ce jour, un modèle murin transgénique de VM associé aux mutations de gain de fonction tie2 n’a pas été rapporté. Les modèles transgéniques actuels de souris VM s’appuient sur l’expression omniprésente ou restreinte de tissu de la mutation activante PIK3CA p.H1047R3,5. Ces animaux transgéniques fournissent un aperçu significatif des effets spécifiques au corps entier ou aux tissus de cette mutation PIK3CA de point chaud. La limitation de ces modèles est la formation d’un réseau vasculaire hautement pathologique ayant pour résultat la létalité tôt. Ainsi, ces modèles de souris ne reflètent pas entièrement l’occurrence sporadique des événements mutationnels et de la nature localisée de la pathologie de VM.
Au contraire, les modèles de xénogreffe dérivés par le patient sont basés sur la transplantation ou l’injection de tissus pathologiques ou de cellules dérivées de patients sur des souris immunodéficientes7. Les modèles Xénogreffe sont un outil puissant pour élargir les connaissances sur le développement des maladies et la découverte de nouveaux agents thérapeutiques8. En outre, l’utilisation de cellules dérivées du patient permet aux scientifiques de récapituler l’hétérogénéité de mutation pour étudier le spectre des phénotypes de patients.
Ici, nous décrivons un protocole où les VM EC dérivés du patient qui expriment une forme mutante constitutivement active de TIE2 et/ou PIK3CA sont injectés sous-cutanéement dans le dos de souris nues athymiques. Les cellules vasculaires injectées sont suspendues dans un cadre ecm afin de promouvoir l’angiogenèse comme décrit dans les modèles xénogreffe vasculaires précédentes9,10,11. Ces EC de VM subissent la morphogenèse significative et génèrent des vaisseaux pathologiques agrandis et perfusés en l’absence de cellules de soutien. Le modèle de xénogreffe décrit de VM fournit une plate-forme efficace pour l’évaluation préclinique des drogues ciblées pour leur capacité à inhiber l’expansion incontrôlée de lumen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous décrivons une méthode pour générer un modèle xénogreffe de VM dérivé du patient. Ce modèle murin présente un excellent système qui permet aux chercheurs d’acquérir une compréhension plus profonde de l’élargissement pathologique des lumens et jouera un rôle déterminant dans le développement de thérapies plus efficaces et ciblées pour le traitement de la VM. Ceci peut être facilement adapté pour étudier d’autres types d’anomalies vasculaires telles que la malformation veineuse lympha…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Nora Lakes pour la relecture. La recherche rapportée dans ce manuscrit a été soutenue par le National Heart, Lung, and Blood Institute, sous le numéro de prix R01 HL117952 (E.B.), qui fait partie des National Institutes of Health. Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.
Materials
| Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weeks, males | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | Subcutaneous injection |
| Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I) | Vector Laboratories | B-1065 | Histological anlaysis |
| Bottle top filter (500 ml; 0.2 µM) | Thermo Fisher | 974106 | Cell culture |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BSA | A7906-50MG | Cell culture; Histological analysis |
| Calcium cloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma | C7902-500G | Cell culture |
| Caliper | Electron Microscopy Sciences | 50996491 | Lesion plug measurment |
| CD31-conjugated magnetic beads (Dynabeads) | Life Technologies | 11155D | EC separation |
| Cell strainer (100 μM) | Greiner | 542000 | Cell culture |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (15 mL) | Greiner | 07 000 241 | Cell culture |
| Conical Tube; polypropylene (50 mL) | Greiner | 07 000 239 | Cell culture |
| Coplin staining jar | Ted Pella | 21029 | Histological anlaysis |
| Coverglass (50 X 22 mm) | Fisher Scientific | 12545E | Histological anlaysis |
| DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB) | Vector Laboratories | SK-4105 | Histological anlaysis |
| Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 10-027-CV | Cell culture |
| DynaMag-2 | Life Technologies | 12321D | EC separation |
| Ear punch | VWR | 10806-286 | Subcutaneous injection |
| EDTA (0.5M, pH 8.0) | Life Technologies | 15575-020 | Histological anlaysis |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basal medium and supplements) | Lonza | CC-3162 | Cell culture |
| Eosin Y (alcohol-based) | Thermo Scientific | 71211 | Histological anlaysis |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | Histological anlaysis |
| Fetal Bovine Serum (FBS) , HyClone | GE Healthcare | SH30910.03 | Cell culture |
| Filter tip 1,250 μL | MidSci | AV1250-H | Multiple steps |
| Filter tip 20 μL | VWR | 10017-064 | Multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 10017-068 | Multiple steps |
| Formalin buffered solution (10%) | Sigma | F04586 | Lesion plug dissection |
| Hemacytometer (INCYTO; Disposable) | SKC FILMS | DHCN015 | Cell culture |
| Hematoxylin | Vector Hematoxylin | H-3401 | Histological anlaysis |
| Human plasma fibronectin purified protein (1mg/mL) | Sigma | FC010-10MG | Cell culture |
| Hydrogen Peroxide solution (30% w/w) | Sigma | H1009 | Histological anlaysis |
| ImageJ Software | Analysis | ||
| Isoflurane, USP | Akorn Animal Health | 59399-106-01 | Subcutaneous injection |
| magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma | M1880-500G | Cell culture |
| Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free) | Corning | 356237 | Subcutaneous injection |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | VWR | 87003-294 | EC separation |
| Microscope Slide Superfrost (75mm X 25mm) | Fisher Scientific | 1255015-CS | Histological anlaysis |
| Needles, 26G x 5/8 inch Sub-Q sterile needles | Becton Dickinson (BD) | BD305115 | Subcutaneous injection |
| Normal horse serum | Vector Laboratories | S-2000 | Histological anlaysis |
| Penicillin-Streptomycin-L-Glutamine (100X) | Corning | 30-009-CI | Cell culture |
| Permanent mounting medium (VectaMount) | Vector Laboratories | H-5000 | Histological anlaysis |
| Pestle Size C, Plain | Thomas Scientific | 3431F55 | EC isolation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3994 | Cell culture |
| Scale | VWR | 65500-202 | Subcutaneous injection |
| Serological pipettes (10 ml) | VWR | 89130-898 | Cell culture |
| Serological pipettes (5ml) | VWR | 89130-896 | Cell culture |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma | 223530 | Cell culture |
| Streptavidin, Horseradish Peroxidase, Concentrate, for IHC | Vector Laboratories | SA-5004 | Cell culture |
| Syringe (60ml) | BD Biosciences | 309653 | Cel culture |
| SYRINGE FILTER (0.2 µM) | Corning | 431219 | Cell culture |
| Syringes (1 mL with Luer Lock) | Becton Dickinson (BD) | BD-309628 | Subcutaneous injection |
| Tissue culture-treated plate (100 X 20 mm) | Greiner | 664160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plate (145X20 mm) | Greiner | 639160 | Cell culture |
| Tissue culture-treated plates (60 X 15) mm | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Tris-base (Trizma base) | Sigma | T6066 | Histological anlaysis |
| Trypan Blue Solution (0.4 %) | Life Technologies | 15250061 | Cell culture |
| Trypsin EDTA, 1X (0.05% Trypsin/0.53mM EDTA) | Corning | 25-052-Cl | Cell culture |
| Tween-20 | Biorad | 170-6531 | Histological anlaysis |
| Wheaton bottle | VWR | 16159-798 | Cell culture |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3P-1GAL | Histological anlaysis |
Referencias
- Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management. Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).
- Limaye, N., et al. Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations. Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).
- Castel, P., et al. Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations. Science Translational Medicine. 8 (332), 42 (2016).
- Limaye, N., et al. Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation. The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).
- Castillo, S. D., et al. Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans. Science Translational Medicine. 8 (332), 43 (2016).
- Stratman, A. N., et al. Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices. Blood. 114 (2), 237-247 (2009).
- Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models. Cells. 8 (8), 889 (2019).
- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
- Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74 (2011).
- Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
- Roh, Y. N., et al. The results of surgical treatment for patients with venous malformations. Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).
- Marler, J. J., Mulliken, J. B. Current management of hemangiomas and vascular malformations. Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).
- Goines, J., et al. A xenograft model for venous malformation. Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).
- Li, X., et al. Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).
- Le Cras, T. D., et al. Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation. Angiogenesis. , 1-18 (2020).
- Boscolo, E., et al. Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).
