Summary

Voorbereiding van de rattenzangplooi voor neuromusculaire analyses

Published: May 15, 2020
doi:

Summary

Dit protocol beschrijft methoden die worden gebruikt om de stemplooien van ratten voor te bereiden op histochemisch neuromusculair onderzoek.

Abstract

Het doel van deze tutorial is om de voorbereiding van de stemplooi van de rat voor histochemische neuromusculaire studie te beschrijven. Dit protocol schetst procedures voor larynxdissectie van ratten, flash-bevriezing en cryosectie van de stemplooien. Deze studie beschrijft hoe cryosectie stemplooien in zowel longitudinale als cross-sectionele vlakken. Een nieuwigheid van dit protocol is de larynxtracking tijdens cryosectioning die zorgt voor een nauwkeurige identificatie van de intrinsieke larynxspieren en de kans op weefselverlies vermindert. Cijfers tonen de progressieve cryosectie in beide vlakken aan. Negenentwintig rattenhemi-larynges werden gecryopteerd en gevolgd vanaf het verschijnen van het schildklierkraakbeen tot het verschijnen van het eerste gedeelte dat de volledige stemplooi omvatte. De volledige stemplooi werd gevisualiseerd voor alle dieren in beide vlakken. Er was een grote variabiliteit in de afstand van het verschijnen van het schildklierkraakbeen tot het verschijnen van de volledige stemplooi in beide vlakken. Gewicht was niet gecorreleerd aan de diepte van larynxoriëntatiepunten, wat suggereert dat individuele variabiliteit en andere factoren die verband houden met weefselvoorbereiding verantwoordelijk kunnen zijn voor de hoge variabiliteit in het uiterlijk van oriëntatiepunten tijdens secties. Deze studie beschrijft een methodologie en presenteert morfologische gegevens voor het voorbereiden van de stemplooi van de rat voor histochemisch neuromusculair onderzoek. Vanwege de hoge individuele variabiliteit moeten larynxoriëntatoren tijdens cryosectie nauwlettend worden gevolgd om oversectioning van weefsel en weefselverlies te voorkomen. Het gebruik van een consistente methodologie, inclusief adequate weefselvoorbereiding en bewustzijn van oriëntatiepunten in het strottenhoofd van de rat, zal helpen bij consistente resultaten in alle onderzoeken en nieuwe onderzoekers helpen die geïnteresseerd zijn in het gebruik van de stemplooi van de rat als een model om larynx neuromusculaire mechanismen te onderzoeken.

Introduction

Het strottenhoofd van de rat is een goed ingeburgerd model om structurele en functionele neuromusculaire larynxaanpassingen aan ontwikkeling, veroudering, ziekte en farmacologische agentia te onderzoeken1,2,3,4,5. Consistentie van histologische methoden is van cruciaal belang voor deze manier van werken, omdat er meerdere fijne kneepjes betrokken zijn bij spiervoorbereiding en -analyse, evenals uitdagingen in verband met larynxgrootte, vorm en topografie van de spieren ingekapseld in het larynxkarbeen1,6,7,8,9,10,11 . Vanwege de kleine omvang van de intrinsieke strottenhoofdspieren van de rat zijn systematische inbedding, bevriezing en cryosectie van cruciaal belang om consistente en nauwkeurige resultaten te bereiken. Bijvoorbeeld, bij het snijden van de stemplooi van de rat in het coronale vlak, bevinden de neuromusculaire juncties (NMJ’s) van vier van de intrinsieke larynxspieren zich binnen minder dan 1,8 mm weefseldiepte11. Daarom is nauwkeurige monitoring van de anatomie van de larynxspier tijdens cryosectioning noodzakelijk om de sectie (s) van belang nauwkeurig te identificeren en oversectie van weefsel te voorkomen. Oversectie van de doelspier kan resulteren in een onnauwkeurige identificatie van het aantal en de topografie van NMJ’s11 of kan resulteren in een algehele vermindering van de steekproefgrootte als de doelspier wordt weggegooid als gevolg van oriëntatierichtingsverwarring12. Aangezien nieuwe modellen voor de studie van larynxspieren en hun respectieve aanpassingen worden ontwikkeld, zijn standaard operationele procedures essentieel om ervoor te zorgen dat de resultaten nauwkeurig, betrouwbaar en reproduceerbaar zijn in alle onderzoeken.

Het doel van dit artikel is om de voorbereiding van de stemplooi van de rat te detailleren voor optimale longitudinale en cross-sectionele analyse. Gedetailleerde methoden die regelmatig in ons laboratorium worden gebruikt, worden beschreven om doelspieroriëntatoren tijdens cryosectie te identificeren. Hoewel vergelijkbare methoden in verschillende laboratoria worden gebruikt, wordt hier meer detail verstrekt dan in de literatuur om betrouwbare en nauwkeurige replicatie te garanderen wanneer deze door beginnende onderzoekers wordt geïmplementeerd. Het doel van deze tutorial is om een standaardmethodologie te bieden voor immunohistochemische (IHC) evaluatie van de stemplooi van de rat om de consistentie tussen laboratoria en onderzoeken te verbeteren.

Protocol

Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de Institutional Animal Care and Use Committee van de New York University School of Medicine. 1. Ontleed het strottenhoofd van de rat Euthanaseer rat volgens het institutioneel goedgekeurde protocol. Scheer de ventrale nek van de onderkaak tot het schoorsteenvlies en veeg met alcohol om bontbesmetting in de weefselmonsters te voorkomen. Onder een ontleedbare scope met 10x vergroting wordt het hele strottenhoofd weggesneden …

Representative Results

De representatieve resultaten maakten deel uit van een lopend onderzoek naar de effecten van vocale oefening op het larynx neuromusculaire systeem. Negenentwintig mannelijke Fischer 344/bruine Noorse ratten (12 9 maanden oud, 17 24 maanden oud) werden gewogen en geëuthanaseerd met CO2-inhalatie gevolgd door een bilaterale thoracotomie. De procedures volgden het geschetste protocol om NMJ’s en vezelgrootte van de laterale en mediale TA-spieren te labelen. De afstand tussen larynxori…

Discussion

Het voorbereiden van stemplooien van ratten voor neuromusculaire analyse kan verschillende uitdagingen met zich meebrengen. Niet alleen zijn larynxspieren klein en omgeven door kraakbeen, waardoor het moeilijk is om direct doelspier te extraheren, er werd ook een hoge variabiliteit gevonden tussen dieren in de diepte van larynxanatomische oriëntatiepunten. Voor spier het cross-section plane protocol, volledige stemplooisecties verschenen tussen 21−85 secties (10 μm per sectie) na het eerste verschijnen van het ventra…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) en K23DC014517 (Johnson, PI) van het National Institute on Deafness and other Communication Disorders van de National Institutes of Health.

Materials

2-Methylbutane Certified Fisher Chemical 35514
Aluminum Foil Fisherbrand 1213101
Cryo Tongs SS Thermo Scientific 11679123
Cryostat Leica Biosystems CM3050
Cryostat blades C.L. Sturkey D554X50 22-210-045
Disposable Base Molds 15mm x 15mm Thermo Scientific 41-741
Disposable Underpads Medline 23-666-062
Dissection kit Thermo Scientific 9996969
DPBS – Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190136
Frozen Section Medium Fisher Healthcare 23-730-571
Ice Bucket Bel-Art 11999054
Immunostain Moisture Chamber Ted Pella Inc NC9425474
Needle holders Assi ASSI.B148
Non-Woven Sponges, 4 Ply Quick Medical 9023
Orbital shaker Troemner 02-217-987
Pap pen
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free Alfa Aesar 50-00-0
Premium Microcentrifuge Tubes Fisherbrand 5408129
Specimen Storage Bags Fisherbrand 19240093
Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL Polar Ware 114231B
Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 12-550-15
Task wiper Kimberly-Clark Professional™ 34155 06666A
Timer Fisherbrand 2261840
Vannas Pattern Scissors Assi ASSI.SAS15RV
NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods.

Referencias

  1. Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), 579-586 (2002).
  2. Suzuki, T., et al. Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962 (2002).
  3. Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. R. Changes in Rat 50-kHz Ultrasonic Vocalizations During Dopamine Denervation and Aging: Relevance to Neurodegeneration. Current Neuropharmacology. 13 (2), 211-219 (2015).
  4. Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context. Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).
  5. Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. M. Foxp2 mediates sex differences in ultrasonic vocalization by rat pups and directs order of maternal retrieval. Journal of Neuroscience. 33 (8), 3276-3283 (2013).
  6. Basken, J. N., Connor, N. P., Ciucci, M. R. Effect of aging on ultrasonic vocalizations and laryngeal sensorimotor neurons in rats. Experimental Brain Research. 219 (3), 351-361 (2012).
  7. Ciucci, M. R., et al. Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats. Behavioral Neuroscience. 123 (2), 328-336 (2009).
  8. Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease. Journal of Communication Disorders. 43 (4), 319-326 (2010).
  9. Nagai, H., Ota, F., Konopacki, R., Connor, N. P. Discoordination of laryngeal and respiratory movements in aged rats. American Journal of Otolaryngology. 26 (6), 377-382 (2005).
  10. Ma, S. T., Maier, E. Y., Ahrens, A. M., Schallert, T., Duvauchelle, C. L. Repeated intravenous cocaine experience: development and escalation of pre-drug anticipatory 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats. Behavioural Brain Research. 212 (1), 109-114 (2010).
  11. Inagi, K., Schultz, E., Ford, C. N. An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function. Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).
  12. Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. M. Laryngeal Neuromuscular Response to Short- and Long-Term Vocalization Training in Young Male Rats. Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 62 (2), 247-256 (2019).
  13. Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do’s and don’ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. Journal of Visualized Experiments. (99), e52793 (2015).
  14. McMullen, C. A., Andrade, F. H. Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (4), 435-442 (2009).
  15. McMullen, C. A., et al. Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle. Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).
  16. Lenell, C., Johnson, A. M. Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat. Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).
  17. Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).
  18. Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats. Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).

Play Video

Citar este artículo
Lenell, C., Shembel, A. C., Johnson, A. M. Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses. J. Vis. Exp. (159), e61327, doi:10.3791/61327 (2020).

View Video