Il protocollo presentato descrive il trasporto e la preparazione del tessuto ippocampale umano resected con l’obiettivo finale di utilizzare fette cerebrali vitali come strumento di valutazione preclinica per potenziali sostanze antietiche.
L’epilessia colpisce circa l’1% della popolazione mondiale e porta a una grave diminuzione della qualità della vita a causa di convulsioni in corso e ad alto rischio di morte improvvisa. Nonostante l’abbondanza di opzioni di trattamento disponibili, circa il 30% dei pazienti è resistente ai farmaci. Diverse nuove terapie sono state sviluppate utilizzando modelli animali, anche se il tasso di pazienti farmacoresisteriati rimane inalterato. Uno dei motivi probabili è la mancanza di traduzione tra i modelli di roditori e gli esseri umani, come una debole rappresentazione della farmacosistenza umana nei modelli animali. Il tessuto cerebrale umano resected come strumento di valutazione preclinica ha il vantaggio di colmare questo divario tras translationale. Descritto qui è un metodo per la preparazione di alta qualità delle fette di cervello ippocampale umano e la successiva induzione stabile dell’attività epileptiforme. Il protocollo descrive l’induzione dell’attività di burst durante l’applicazione di 8 mM KCl e 4-aminopiridin. Questa attività è sensibile ai candidati lacosamide AED stabiliti o nuovi candidati antiepiletici, come la dimetelethanolamina (DMEA). Inoltre, il metodo descrive l’induzione di eventi simili a crisi epilettiche in CA1 di fette cerebrali dell’ippocampo umano mediante la riduzione di Mg2 e l’applicazione della bicucullina, un bloccantedel recettore GABA A. L’impostazione sperimentale può essere utilizzata per screening di potenziali sostanze antietiche per i loro effetti sull’attività epileptiforme. Inoltre, i meccanismi di azione postulati per composti specifici possono essere convalidati utilizzando questo approccio nel tessuto umano (ad esempio, utilizzando registrazioni patch-clamp). Per concludere, lo esame del tessuto cerebrale umano vitale ex vivo (qui, l’ippocampo risected da pazienti affetti da epilessia del lobo temporale) migliorerà l’attuale conoscenza dei meccanismi fisiologici e patologici nel cervello umano.
L’epilessia è uno dei disturbi neurologici più comuni, che colpisce l’1% della popolazione mondiale, ed è associata ad una maggiore morbilità emortalità 1,2. Purtroppo, un terzo dei pazienti affetti da epilessia sono resistenti ai farmaci, nonostante l’abbondanza di opzioni di trattamento disponibili tra cui più di 20 farmaci antiepilettici approvati (AED)3. La mancata traduzione dei risultati della ricerca sugli animali preclinici negli studi clinici è uno dei motivi per cui promettenti strategie di trattamento non sono efficaci in molti pazienti4. Recentemente, neuropeptide Y (NPY) e galanin hanno dimostrato di avere effetti antieettici nei modelli animali; anche se, quando testato nel tessuto cerebrale umano resected, solo NPY era efficace5.
La maggior parte delle conoscenze esistenti riguardanti i meccanismi neurologici di base e gli approcci di terapia della malattia derivano da modelli animali ed esperimenti di coltura cellulare. Anche se informativi, questi modelli rappresentano solo singoli aspetti delle malattie umane complesse e della rete cerebrale umana adulta. In alternativa, il tessuto cerebrale umano ha il potenziale per colmare il divario trasscolare, ma è raramente disponibile per studi funzionali. Per esempio, il tessuto cerebrale post mortem è stato uno strumento prezioso nello studio dell’espressione delle proteine, della morfologia del cervello o delle connessioni anatomiche, anche se l’attività neuronale è spesso compromessa èquesto tessuto 6,7,8,9,10,11.
Al contrario, il tessuto cerebrale umano resito vivente è stato studiato per quanto riguarda la valutazione preclinica dei farmaci, le funzioni neuronali di base e i modelli di espressionegenica 12,13,14,15,16,17. Un grande vantaggio delle fette di cervello umano rispetto alle fette di roditore è la lunga vitalità del tessuto neuronale dopo la resezione e la preparazione. Rispetto alle fette cerebrali dei roditori, che in genere possono essere registrate fino a 8 h dopo la preparazione, le fette del cervello umano mostrano un’attività neuronale stabile fino a 72 h, consentendo un’indagine approfondita di questi campioni rarie preziosi 12,18.
Diversi studi hanno studiato le proprietà dell’attività epileptiforme in varie aree del tessuto umano corticale e ippocampale risentito e hanno utilizzato diversi metodi per l’induzione dell’attività epileptiforme. Nelle fette di roditore, l’attività epileptiforme può essere indotta da diversi metodi: stimolazione elettrica delle cellule di Llar DG, aumento diK extracellulare (8-12 mM KCl), blocco dei recettori GABAA da bicucullina (BIC), blocco dei canali di potassio da 4-aminopiridina (4-AP) e rimozione o riduzione di Mg2 in soluzione extracellulare19. Tuttavia, l’induzione dell’attività epileptiforme nel tessuto umano richiede la combinazione di almeno due dei suddatimetodi 20,21,22.
Presentato qui è un metodo per la preparazione di fette di cervello ippocampale umano, che sono vitali per fino a 20 h e mostrano l’induzione di attività epileptiforme su applicazione dialta K (8 mM) e 4-AP o basso Mg2 e BIC.
Vivere il tessuto cerebrale umano risentito è uno strumento di grande valore nella valutazione preclinica degli EED, in quanto rappresenta correttamente una micro-rete cerebrale umana intatta. Il protocollo presentato descrive un metodo per il trasporto e la preparazione dei tessuti, che garantisce fette di ippocampo di alta qualità, nonché un metodo di induzione stabile per l’attività epilettaforme critica per la valutazione AED.
Lo esame dell’attività epileptiforme e dei metodi per l’induzione chimica o elettrica nelle fette del cervello umano sono stati precedentemente mostratida altri gruppi 17,20,21,22. Questo protocollo descrive l’induzione di un’attività di scoppio stabile nelle fette di diversipazientitramite l’applicazione di un’elevata K – 4-AP e l’induzione di SLE nell’area CA1 tramite l’applicazione di un basso Mg2. Si è scoperto che l’induzione dell’attività di scoppio è più coerente (80% delle fette testate in 15 pazienti) rispetto all’induzione di SLE (50% delle fette testate in un paziente). Tuttavia, finora, l’induzione delle SLE è stata testata solo in un paziente. Tuttavia, si raccomanda l’induzione di SLE da parte di un basso Mg2,poiché le SLE non sono ancora state in grado di essere indotteutilizzandol’elevato K e il 4-AP.
Diversi studi hanno introdotto metodi per il trasporto e la preparazione del tessuto cerebrale umano e spesso evidenziano tre fattori critici per la sopravvivenza neuronale: il tempo di trasporto, le soluzioni di trasporto usate e le condizioni di memorizzazione.
Per una vitalità ottimale della sezione, alcuni gruppi suggeriscono che il trasporto del tessuto cerebrale resected sia il più breve possibile. Tuttavia, le sale operatorie e i laboratori sono raramente nelle immediate vicinanze, il che significa che la qualità delle fette può essere compromessa a causa del trasporto lungo. Alcuni gruppi hanno superato questo ostacolo applicando costante O2 alla soluzione durante il trasporto12. Abbiamo trasportato il tessuto cerebrale per brevi (max 15 min) e lunghi (fino a 1 h) periodi di tempo senza costante ulteriore O2 fornitura durante il trasporto, simile ad altri gruppi18,25. In questi casi, le differenze nella qualità dei tessuti non sono state osservate durante le registrazioni epileptiformi. In comunicazione con altri gruppi del nostro istituto, la qualità delle fette non è stata modificate neanche per gli esperimenti di patch-clamp. Al contrario, la varianza nella qualità dei tessuti deriva probabilmente da danni durante le operazioni, resezione prolungata e procedura di affettatura.
Per quanto riguarda il trasporto e la soluzione di taglio, tutti i metodi pubblicati omettono NaCl dalle soluzioni per ridurre il gonfiore cellulare a causa della pressione osmotica, simile alla procedura standard per gli esperimenti di patch-clamp dei roditori. Tuttavia, finora sono stati introdotti diversi sostituti (ad esempio, aCSF13,22,NMDG-based aCSF12,26e aCSF27a base di colina ). Ting e colleghi hanno introdotto l’aCSF basato su NMDG per la preparazione delle fette nel 201426 e in seguito hanno aggiunto un protocollo di recupero, che lentamente reintroduce NaCl nelle fette28. Tuttavia, come descritto da Ting et al., i neuroni del tessuto cerebrale preparati in aCSF a base di NMDG mostrano una maggiore resistenza alla membrana, influenzando così la tenuta a cellule intere durante gli esperimenti di patch-clamp26. Pertanto, siamo passato da aCSF basato su NMDG all’uso di aCSF20basato sulla colina , che produce fette di alta qualità sia per le registrazioni potenziali sul campo che per le registrazioni patch-clamp.
Per quanto riguarda lo stoccaggio delle fette, è generalmente accettato che le condizioni di interfaccia forniscono un’ossigenazione ottimale critica per la sopravvivenza afettine lunghe 18. Tuttavia, altri gruppi mostrano la sopravvivenza delle fette fino a 72 h in condizioni sommerse12. Contrariamente alle ipotesi precedenti, le fette di cervello umano sembrano essere più resistenti alla bassa ossigenazione o allo stress ossidativo rispetto alle fette di roditore. Principalmente, le camere di interfaccia sono state precedentemente utilizzate per la conservazione di fette di ippocampo umano, anche se le condizioni sommerse sono raccomandate per il mantenimento delle fette del cervello umano negli esperimenti patch-clamp.
Come discusso da altri gruppi, un ulteriore passo critico per la sopravvivenza a fettine lunghe (interfaccia per <48 h18, sommersa per <72 h12) è la prevenzione della contaminazione batterica. Le fette di cervello dei roditori sono tipicamente utilizzate nelle registrazioni elettrofisiologiche fino a 8 h, e la contaminazione batterica non è considerata per influenzare la vitalità della sezione durante questo periodo. Alto numero di fette preparate da una resezione e la disponibilità non comune di tessuto cerebrale umano evidenzia la necessità di prolungare la vitalità delle fette del cervello umano. Questo metodo descrive con successo la preparazione di fette di cervello ippocampale umano vivente, che possono essere facilmente adattate a condizioni sterili. Tuttavia, per le registrazioni eseguite qui, la sopravvivenza delle fette che si estende per 20 h non era una priorità.
La registrazione nelle camere di interfaccia ha anche dimostrato di essere essenziale per l’induzione dell’attività epileptiforme come le SLE22. Le condizioni sommerse, a causa della bassa ossigenazione, sono raramente utilizzate per la registrazione delle SLE; tuttavia, sono necessari per l’alta risoluzione ottica necessaria per gli esperimenti patch-clamp. L’uso di una camera di registrazione di tipo sommersa ottimizzata consente la registrazione dell’attività epileptiforme (campo extracellulare o singolo neurone) nelle fette del cervello umano, a causa dell’alta ossigenazione e dell’applicazionerapida di farmaci 29. Qui, vengono descritti metodi e risultati per le registrazioni potenziali sul campo, ma va sottolineato che le registrazioni patch-clamp sono state eseguite con successo in sezioni di topo e cervello umano utilizzando questa camera di registrazione modificata (dati non mostrati).
Il tessuto cerebrale umano resected ha un valore traslazione più elevato rispetto ai modelli di roditori. Rappresenta una rete neuronale adulta e maesa che non può essere riprodotta da iPSC. Tuttavia, come in qualsiasi sistema in vitro, le fette di cervello umano non rappresentano un cervello umano intatto. Inoltre, le reti neuronali registrate di tessuto cerebrale resected possono subire sostanziali cambiamenti molecolari e funzionali a causa di danni durante il funzionamento o la preparazione. Le procedure di affettatura hanno dimostrato di influenzare la funzione GABAergic e possono influenzare l’induzione dell’attività epileptiforme30. Queste limitazioni devono essere considerate durante la formulazione di un’ipotesi. Quando si testano potenziali farmaci antielettici, l’uso di diverse aree cerebrali dovrebbe essere considerato, come bersagli farmacologici potrebbero non essere espressi in tutte le regioni del cervello umano o tutti i pazienti. In particolare, l’ippocampo dei pazienti affetti da TLE mostra spesso segni di sclerosi ippocampale accompagnata da una grave perdita di cellule neuronali. Si raccomanda di ottenere informazioni sui pazienti sui cambiamenti patologici e sulla storia della malattia, come il potenziale refrattario verso i farmaci, e considerare questo durante l’interpretazione dei dati.
In conclusione, questo metodo descrive con successo la preparazione di fette di cervello ippocampale umano vivente e tecniche di induzione per la registrazione di due diversi tipi di attività epileptiforme. Poiché la disponibilità di tessuto cerebrale umano vivente è rara, le condizioni di trasporto e registrazione ottimizzate dovrebbero essere utilizzate per garantire la massima produzione da esperimenti che utilizzano fette di cervello umano. Si suggerisce che il tessuto cerebrale umano resected può essere utilizzato come strumento di convalida preclinica oltre a modelli di roditori ed esperimenti di coltura cellulare.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Mandy Marbler-Pàtter (Charite-Unversit-tmedizin, Berlino) per un’eccellente assistenza tecnica. P.F. è stato finanziato dalla German Research Foundation (DFG, Deutsche Forschungsgemeinschaft) nell’ambito della strategia di eccellenza tedesca-EXC-2049-390688087. Questo lavoro è stato sostenuto dal CENTRO QUEST per la trasformazione della ricerca biomedica presso l’Istituto di Sanità di Berlino.
(+)-Na L-ascorbate | Sigma Aldrich | A4034 | |
4-AP | Sigma Aldrich | 275875-5G | |
Blades | eliteSERVE GmbH | HW3 | used for the vibratome |
CaCl2 | Merck | 102382 | |
Choline Cl | Sigma Aldrich | C1879 | |
Filter paper | Tiffen | EK1546027T | |
Gas-tight bottle caps | Carl Roth GmbH+Co.KG | E694.1 | |
Glass filaments | Science Products | GB150F-8P | for recording electrodes |
Glass gas disperser | DWK Life Sciences GmbH | 258573309 | |
Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
Interface Chamber | inhouse made | – | see Haas et al., 1979 |
KCl | AppliChem | 131494.1210 | |
Membrane (Cell culture inserts) | Merck | PICM030050 | |
Membrane chamber | inhouse made | – | see Hill and Greenfield, 2011 |
MgCl2∙6H2O | Carl Roth | HNO3.2 | |
MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
Na pyruvate | Sigma Aldrich | P8574 | |
NaCl | Carl Roth | 3957.1 | |
NaH2PO4 | Merck | 106346 | |
NaHCO3 | Carl Roth | HNO1.2 | |
Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
Slice holder | Warner instruments | SHD-41/15 | |
Vertical puller | Narishige | PC-10 | |
Vibratome | Leica | VT1200S |