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Neurociencias

전기 생리학적 기록을 위한 급성 인간 해마 슬라이스의 준비

Published: May 07, 2020
doi:
10.3791/61085
, , , , , ,
1Department of Neurology with Experimental Neurology,Charité-Universitätsmedizin Berlin, Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 2NeuroCure Cluster of Excellence,Charité-Universitätsmedizin Berlin, Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 3Department of Neurosurgery,Charité-Universitätsmedizin Berlin, Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health

Summary

제시된 프로토콜은 잠재적인 항질 물질에 대한 전임상 평가 도구로 중요한 두뇌 조각을 사용하는 궁극적인 목표를 가진 절제된 인간 해마 조직의 수송 그리고 준비를 기술합니다.

Abstract

간질은 세계 인구의 대략 1%에 영향을 미치고 지속적인 포착 때문에 삶의 질에 있는 가혹한 감소및 급격한 죽음을 위한 고위험으로 이끌어 냅니다. 사용 가능한 치료 옵션의 풍부에도 불구하고, 환자의 약 30 %는 약물 내성입니다. 몇몇 새로운 치료는 동물 모형을 사용하여 개발되었습니다, 약 저항하는 환자의 비율은 변경되지 않는 남아 있더라도. 가능한 이유 중 하나는 동물 모델에서 인간의 약동성의 약한 표현과 같은 설치류 모델과 인간 사이의 번역의 부족입니다. 전임상 평가 도구로 서 인간의 뇌 조직을 절제하는 것은 이 번역적 격차를 해소할 수 있는 장점이 있다. 여기에 설명된 인간 해마 뇌 슬라이스의 고품질 제제와 간질 활성의 후속 안정유도를 위한 방법이 있다. 프로토콜은 8 mM KCl 및 4-aminopyridin의 응용 프로그램 도중 버스트 활동의 유도를 설명합니다. 이러한 활동은 디메틸레타놀라민(DMEA)과 같은 확립된 AED 라코사미드 또는 새로운 항질질 제후보에 민감하다. 또한, 이 방법은 세포외 Mg2+ 및 GABAA 수용체 차단제인 비큐컬린의 적용에 의해 인간 해마 뇌 슬라이스의 CA1에서 발작과 같은 사건의 유도를 설명합니다. 실험 설정은 간질 활성에 미치는 영향에 대한 잠재적인 항간질 물질을 선별하는 데 사용할 수 있습니다. 더욱이, 특정 화합물에 대 한 가정 된 행동의 메커니즘 인간의 조직에서이 접근 방식을 사용 하 여 유효성을 검사 할 수 있습니다 (예를 들어, 패치 클램프 기록을 사용 하 여). 결론적으로, 중요한 인간 두뇌 조직 ex vivo의 조사 (여기, 측두엽 간질때문에 손해를 입는 환자에게서 해마를 절제) 인간 두뇌에 있는 생리및 병리학 기계장치의 현재 지식을 향상시킬 것입니다.

Introduction

간질은 세계 인구의 1%에 영향을 미치는 가장 흔한 신경 장애 중 하나이며, 증가된 이환율 및 사망률1,,2와관련이 있다. 불행히도, 간질을 앓고 있는 환자의 1/3은 20개 이상의 승인된 항간질제(AEDs)3이상을포함하여 이용 가능한 치료 옵션이 풍부했음에도 불구하고 약물 내성이다. 임상 전 동물 연구에서 임상 시험에 결과를 번역하지 못하는 것은 유망한 치료 전략이 많은 환자4에서효과적이지 못하는 이유 중 하나입니다. 최근에는 신경펩타이드 Y(NPY)와 갈라닌이 동물 모델에서 항질효과가 있는 것으로 나타났다. 하지만, 절제된 인간의 뇌 조직에서 테스트할 때, 만 NPY 는5효과가 있었다.

기본적인 신경학상 기계장치 및 질병 치료 접근에 관하여 기존 지식의 대부분은 동물 모형 및 세포 배양 실험에서 유래합니다. 유익한, 이러한 모델은 복잡 한 인간 질환과 성인 인간의 두뇌 네트워크의 단일 측면을 나타냅니다. 대안적으로, 인간의 뇌 조직은 번역 격차를 해소 할 수있는 잠재력을 가지고 있지만 기능적 연구에 거의 사용할 수 없습니다. 예를 들어, 사후 뇌 조직은 단백질 발현, 뇌 형태학 또는 해부학적 연결을 조사하는 데 중요한 도구가 되어 왔지만, 신경 활동은 종종 손상되어 이 조직6,,7,8,8,9,,10,,11이조직이다.

대조적으로, 살아있는 절제된 인간 뇌 조직은 전임상 약물 평가, 기본 신경 기능 및 유전자 발현 패턴12,,13,,14,,15,,16,17에관하여 조사되고있다. 설치류 조각에 비해 인간의 뇌 슬라이스의 큰 장점은 절제 및 준비 후 신경 조직의 긴 생존력이다. 설치류 뇌 슬라이스에 비해, 이는 일반적으로 준비 후 최대 8 시간 동안 기록 될 수있다, 인간의 뇌 조각은 최대 72 h에 대한 안정적인 신경 활동을 보여, 이러한 희귀하고 가치있는 샘플의 철저한 조사를 가능하게12,,18.

몇몇 연구 결과는 절제된 피질 및 해마 인간 조직의 각종 지역에 있는 간질 편활동의 속성을 조사하고 간질 활성의 유도를 위한 다른 방법을 이용했습니다. 설치류 슬라이스에서 간질 활성은 DG 하이라 세포의 전기 자극, 세포외 K+ (8-12 mM KCl 증가), BIcuculline (BIC)에 의한 GABAA 수용체 차단, 4-aminopyridine (4-AP)에 의한 칼륨 채널 차단, 제거 또는 Mg2+제거 또는 감소Mg 2+ 여러 가지 방법에 의해 유도 될 수 있습니다. 그러나, 인간 조직에서 간질활성을 유도하는,것은 상기방법(20,21,,22)의적어도 2개의 조합을 필요로 한다.

여기에 제시인간의 해마 뇌 슬라이스의 준비를위한 방법이다, 이는 최대 20 시간 동안 실행 가능하고 높은 K+ (8 mMM) 및 4-AP 또는 낮은 Mg2 + 및 BIC의 응용 프로그램에 따라 간질 활동의 유도를 표시합니다.

Protocol

환자는 수술 전에 정보에 입각한 서면 동의를 제공해야 하며, 필요한 윤리적 합의는 실험 전에 시행되어야 합니다. 대표적인 결과에 관하여, 인간 참가자와 관련된 모든 연구 결과는 베를린 (EA2/111/14)에 의해 검토되고 승인되었습니다. 1. 10x 솔루션 준비 참고: 인간의 뇌 조직에 대한 접근을 계획하는 데 어려움이 있기 때문에 여기에 설명된 대로 10x 솔루션을 준비하는 것이 좋습니다. 또는 최종 1x 용액은 이중 증류수(ddH2O)에 최종 농도의 개별 물질을 추가하여 신선하게 제조할 수 있다. 개별 10x 용액의 경우 표 1에 따라 ddH2O에 물질을 추가하고 용해 될 때까지 저어줍니다. 준비 후 최대 10x 솔루션을 사용하십시오(냉동 10배 콜린 aCSF의 경우 최대 1년). 10x 콜린 aCSF의 경우, 10x 1.1 콜린 aCSF(표 1)의50 mL 알리쿼트를 준비하고 추가 사용이 될 때까지 -20 °C 또는 -80 °C에서 동결하십시오.참고: 박테리아와 탄산칼슘의 침전을 방지하기 위해 포도당과 CaCl2 ~ 10x 1.1 콜린 aCSF를 추가하지 마십시오. 10x 솔루션 2는 모든 1x 최종 솔루션에 사용할 수 있는 반면, 10x 솔루션 1.1-1.4는 사용자 정의되고 그에 따라 명명됩니다(표1). 2. 1x 최종 솔루션 준비 참고: 최종 1x 솔루션은 사용 전날 가능한 한 신선하거나 가장 일찍 준비해야 합니다. 모든 최종 솔루션은 유리 가스 분산기를 사용하여 5% CO2 및 95% O2로 발보화되어야 하며, pH를 7.4(최대 = 7.4±0.2)로 조정해야 한다. 운송 및 준비를 위한 콜린 aCSF 최종 500mL 용액의 경우, 37°C 수조에서 콜린 aCSF용 10x 용액 1.1 알리쿼트의 50mL 알리쿼트를 해동한다. 10x 용액 1.1 mL및 50mL의 해동 된 50 mL 알리쿼트(10x 용액 2 ~약 300mL)를 ddH2O의 해동된 50mL 알리쿼트에 추가한다. 포도당과 CaCl2의 최종 농도를 추가한 다음 용해 될 때까지 저어줍니다(표 1,용액 1.1). 500mL의 최종 부피에 ddH2O를 추가하고 진동(300m ±10m)을 측정합니다. 선택적으로 필터를 사용하여 솔루션을 살균하십시오(멸균 조건에서 장기간 슬라이스 생존 가능성에 대한 토론 참조). 수술실에서 실험실로 운송할 수 있도록 1x 콜린 aCSF의 약 100mL로 별도의 병을 채웁니다. 선택 사항: 수술실에서 실험실로의 운송 시간에 따라 가스가 단단한 병 캡을 사용하여 운송 기간이 길어지면 aCSF의 안정적인 pH를 보장하는 것이 좋습니다. 최종 용액을 추가 사용전까지 4-8°C에 저장합니다. 작동 당일, 카보겐 가스에 연결된 유리 가스 분산기(5% CO2,95% O2)를사용하여 얼음과 카보게네이트에 1배 콜린 aCSF를 최소 10~15분 동안 냉각시키세요.참고: 대기 시간이 길어지면 가스병을 수술실에 접근할 수 있도록 하는 것이 좋습니다. 그러나, 우리는 길고 짧은 수송 시간 (15 분 대 60 분) 전에 재 carbogenation 없이 해마 조직을 수송하고 간질 활동의 유도에 있는 다름을 관찰하지 않았습니다. 저장 및 녹화를 위한 aCSF 최종 2L 용액의 경우 10x 용액 1.2(aCSF)의 200mL과 10x 용액 2 및 포도당(표1)의200mL를 ddH2O의 ~1500mL에 추가한다.참고: 최종 솔루션의 볼륨은 적용된 실험과 저장 및 기록에 사용되는 챔버 유형에 따라 달라집니다. 2 L의 최종 볼륨에 ddH2O를 추가하고 진동 (300 mOsm ±10 mOsm)을 측정합니다. 용액을 35°C로 미리 떼어내고 사용 전에 최소 10-15분 동안 카보게네이트를 사용한다. 버스트 액티비티 유도를 위한 하이K++4-AP ACSF 최종 1L 용액의 경우 10x 용액 100mL(highK++4-AP aCSF) 및 10x 용액 2 ~700mL의 100mL를 ddH2O의 100mL를 추가하십시오. 표 1에따라 포도당 및 4-AP(최종 농도 = 100 μM)를 추가합니다. DdH2O를 1L의 최종 볼륨에 추가하고 진동(300m ±10 mOsm)을 측정합니다. 용액을 35°C로 미리 떼어내고 사용 전에 최소 10-15분 동안 카보게네이트를 사용한다. 발작과 같은 이벤트 (SLEs)의 유도를위한 LowMg2 ++BIC aCSF 최종 1L 용액의 경우 10x 용액 1.4(lowMg2++BIC aCSF) 100mL과 10x 용액 2 ~700mLddH2O를 추가하십시오. 표 1에따라 포도당 과 BIC (최종 농도 = 10 μM)를 추가합니다. DdH2O를 1L의 최종 볼륨에 추가하고 진동(300m ±10m)을 측정합니다. 용액을 35°C로 미리 떼어내고 사용 전에 최소 10-15분 동안 카보게네이트를 사용한다. 3. 인터페이스 챔버의 준비 인터페이스 챔버에서 슬라이스는 세 겹의 필터 용지에 놓아 슬라이스 아래에 충분한 양의 솔루션을 보장합니다. 이를 위해 각 슬라이스 홀딩 컴파트먼트에 대해 2 ~4cm x ~2cm의 필터 용지 조각을 자르고 (설명 된 인터페이스 챔버는 두 개의 구획으로 구성되어 있음) 서로 위에 놓습니다. 얇은 면 끈을 4cm x 2cm 필터 용지 에 배치하여 용액의 장력을 깨냅니다. 균일 한 흐름을 확인 (여기에, 검은 나일론 스타킹은 얇은 컷 문자열로 잘라 ~ 길이 ~ 10cm가 사용됩니다; 배치, 그림 1참조). 작은 필터 용지를 슬라이스 홀딩 구획 안에 큰 필터 용지 위에 놓습니다. 작은 필터 조직 조각은 대략 하나의 뇌 슬라이스 (~1.5cm x ~1.0cm)의 크기여야하며 개별 조각을 더 많이 처리 할 수 있습니다. 각 구획에 3~4개의 작은 필터 용지를 놓습니다. 연동 펌프로 1.8mL/min의 aCSF 유속을 보장합니다. -35°C로 인터페이스 챔버를 카보게네이트하고 예열한다(슬라이스의 최종 온도는 ~32°C여야 한다). 4. 준비 영역 설정 참고: 오염을 방지하고 슬라이스 생존을 위해 멸균 조건에서 준비할 수 있습니다. 그러나 모든 진동이 멸균 후드 아래에 맞는 것은 아니며, 준비 중에 오염을 줄이기 위해 다른 조치가 필요합니다. 이 섹션에서는 이러한 측정값 중 일부를 설명합니다. 준비 영역을 70% EtOH로 닦고 알루미늄 호일 또는 멸균 커버를 해당 영역 위에 놓습니다. 슈퍼 접착제, 두 개의 날카로운 핀셋, 주걱, 블레이드가있는 메스, 뇌 조직의 거친 절단을위한 블레이드를 준비하십시오. 오염을 줄이기 위해 절차 전에 도구를 멸균할 수 있습니다. 진동의 완충 트레이와 표본 판을 70% EtOH로 닦아냅니다. 완충 용지함이 완전히 건조되면 알루미늄 호일로 덮고 트레이를 얼음 욕조에 놓습니다. 얼음 욕조를 분쇄된 얼음으로 채우고 준비될 때까지 -20°C에서 보관하십시오. 진동과 면도날을 70% EtOH로 닦고 진동을 보정하여 슬라이스 시술 시세로 수직 진동과 조직 손상을 최소화합니다. 5. 조직 슬라이스 및 보관 절제술 직후, 조직을 차갑고 발보화된 콜린 aCSF에 즉시 배치하고 실험실로 신속하게 이송하십시오.주의: 인간의 뇌 조직이 잠재적인 병원균을 포함할 수 있기 때문에 준비 중에 항상 장갑과 얼굴 마스크를 착용하십시오. 또한, 멸균 후드 아래에서 작동하지 않을 때 얼굴 마스크를 착용하면 용액과 뇌 조직의 오염을 크게 줄일 수 있습니다. 콜린 aCSF에서 조직을 제거하고 조직의 연소 된 부분을 잘라. 절단 각도 및 조직 층을 고려하면서, 시편 접시에 조직 조각을 접착제균표면을 잘라. 이상적으로, 해마 슬라이스에는 DG, CA1-4 및 (가능한 경우) 기체가 포함되어 있습니다. 뇌 조직을 400 μm 두께의 슬라이스로 자르고 절단 하는 동안 진폭과 속도를 조정합니다. 가능한 남아 있는 피아 mater, 인간의 뇌 조직 더 많은 저항을 표시 하 고 느린 절단을 요구할 수 있습니다.참고: 슬라이스 두께는 사용 가능한 네트워크(더 두꺼운 슬라이스의 더 많은 뉴런) 또는 슬라이스의 생존 가능성(용액이 슬라이스에 침투함)에 크게 영향을 미칩니다. 우리는 500 μm 슬라이스를 사용하여 잠재적으로 사용 가능한 마이크로 네트워크를 증가시키고 간질 활성 유도의 차이를 관찰 할 수 없었습니다. 300 μm 슬라이스는 패치 클램프 실험에 일반적으로 사용되지만, 이러한 슬라이스에서 간질 활성의 유도는 아직 여기에서 테스트되지 않았습니다. 우리는 표준 슬라이스 두께로 400 μm을 사용하지만 300-500 μm 슬라이스는 충분할 수 있습니다. 수집하기 전에 메스를 사용하여 뇌 조각의 크기를 줄여 기록 실에 맞춥습니다. 멤브레인 챔버 (섹션 6 참조)의 사용을 위해, 슬라이스는 최대 1.5cm x 1cm이어야한다. 감소하는 동안, 기록에 대해 그대로 필요한 특정 레이어 및 연결을 고려하십시오 (예 : CA1 및 DG에서 기록하기 위해, 수분 및 주변 흰색 조직을 잘라냅니다). 주걱과 작은 집게를 사용하여, 신중하게 작은 필터 용지에 인터페이스 챔버에 조각을 배치하고 기록 될 때까지 aCSF에서 ~ 1 h에 대한 휴식을 보자. 슬라이스는 최대 20시간 동안 기록할 수 있습니다(멸균 조건 하에서 더 길어질 때 더 길어지면). 6. 간질 활성 기록 멤브레인 챔버(침수형 기록 챔버)에서 뇌 슬라이스를 투명한 반과성 멤브레인에 놓으며, 이는 플라스틱링(24)에붙어 있다. 이를 위해 슈퍼 접착제를 사용하여 세포 배양 인서트막에 플라스틱 링을 부착하십시오. 메스를 사용하여 플라스틱 링 바깥쪽에 있는 멤브레인을 제거합니다. 멤브레인을 챔버에 넣기 전에 멤브레인이 링에 균일하고 완전히 부착되어 있는지 확인하십시오.참고: 멤브레인은 4-8°C에서 ddH2O로 저장하고 최대 1개월 동안 재사용할 수 있습니다. 멤브레인을 항상 젖게 하십시오. 멤브레인 챔버의 유입및 유출은 모두 용액 공급을 위해 튜브에 연결됩니다. 튜브를 연동 펌프에 배치하여 유입및 유출이 반대 방향으로 이동되도록 합니다. 모든 튜브와 챔버가 용액으로 채워질 때까지 유입 및 유출 튜브를 발보화된 사전 웜 aCSF에 배치합니다. 연동 펌프의 속도를 조정하여 10-13mL/min의 균일한 유속을 달성합니다.참고: 여기서 사용되는 멤브레인 챔버는 높은 유량, 침수형 기록 챔버로 최대 14mL/min24의용액 흐름을 가능하게 한다. 다른 침수형 기록 챔버를 사용하는 경우 유량을 조정해야 합니다. 그러나, 간질 활성의 유도를 위해, 멤브레인 챔버를 사용하는 것이 좋습니다. 32°C의 안정적인 온도를 보장하기 위해 멤브레인 챔버에 근접하여 유입에 연결된 발열체를 사용합니다. 수직 풀러를 사용하여 1-2 MΩ 유리 파이펫을 준비합니다. 154m NaCl 솔루션으로 파이펫을 채우고 전극 홀더에 넣습니다. 핀셋과 주걱을 사용하여, 작은 필터 종이로 슬라이스를 복용하고 발보 aCSF로 채워진 페트리 접시에 모두 배치하여 인터페이스 챔버에서 해마 조각을 제거합니다. 해마 슬라이스에서 작은 필터 용지를 제거하고(필요한 경우) 파이펫을 사용하여 조각을 필터 용지에서 분리합니다. 슬라이스를 뒤집지 않도록 주의하십시오. 슬라이스를 레코딩 챔버에 놓고 슬라이스 메시를 사용하여 제자리에 고정합니다.참고: 베르누이의 원리로 인해 사용된 침수형 멤브레인 챔버에서 슬라이스는 일반적으로 추가 슬라이스 메시를 사용하지 않고 안정적입니다. 전극을 영역 및 관심 층(여기, CA1)에 배치하고 레코딩을 시작합니다. 현재 클램프 모드에서 10~20kHz의 샘플링 속도와 2kHz에서 필터링된 로우 패스로 필드 잠재적 활동을 기록합니다. 최대 5분 동안 aCSF에서 기저 활동을 기록합니다. 유입 튜브를 aCSF에서 하이K++4AP 또는 lowMg2++BIC aCSF 및 유출 튜브로 전환하여 솔루션의 혼합을 방지합니다. 2분 후, 유출 튜브를 유입과 동일한 솔루션에 배치하여 용액을 보존합니다. highK++4-AP에 의해 유도된 버스트 활성은 세척 후 2-5 분 후에 표시되어야 합니다. 그러나, 낮은Mg2++BIC에 의한 SL의 유도는 최대 30분이 걸릴 수 있다. 필요한 경우 최적의 결과를 얻기 위해 전극의 위치를 신중하게 변경합니다. 최종 위치에 도착하면 기준 활동을 최소 20분 동안 기록합니다. SL을 기록하는 경우 SL의 빈도가 낮기 때문에 기준 기록을 더 길게 고려해야 합니다. 기준선 활성이 안정적인 경우(이벤트 주파수의 고원), 원하는 약물로 세척한다. 약물의 유량 세척이 높기 때문에 2-5 분밖에 걸리지 않으므로 빠른 용액 교환이 가능합니다. 적어도 20 분의 약물 적용 중 활성을 기록, 세척 다음. 활동은 적어도 60-90 분 동안 안정적이어야하며, 더 긴 녹음을 허용합니다. 7. 분석 사용 가능한 소프트웨어로 주파수 및 진폭 분석을 수행할 수 있습니다. 지금까지 우리는 SL 또는 버스트 활동에 대한 신뢰할 수있는 자동 분석을 수립 할 수 없었고 대신 식별 된 활동의 시각적 확인을 통해 반자동 분석을 사용했습니다. 버스트 활동은 biphasic, 양수 및 음의 편향 및 ≥100 ms의 지속 시간을 특징으로 하며, 버스트 활동(예를 들어, 임계값 분석에 의한 반자동)으로 시각적으로 식별되는 모든 이벤트는 분석된 시간 동안 이벤트 주파수(이벤트 간 간격, IEI), 진폭 및 총 이벤트 수를 추가 분석하기 위해 수동으로 표시되어야 합니다.참고: 버스트 활동의 빈도가 높기 때문에 각 응용 단계의 마지막 5분은 일반적으로20을분석합니다. SL은 Heuzeroth 외에서 설명한 바와 같이 분석될 수 있다. 식별된 SL은 지속 시간, 진폭, 스파이크 주파수 및 강장제(고주파 스파이크) 대 클로닉(저주파 스파이크) 위상 지속시간 동안 더욱 분석될 수 있다. 지속 시간 및 10s인 SL은 분석에서 제외해야 합니다.참고: 가능한 항간질 물질의 전임상 평가를 위해, 파열 활성(highK++4AP에 의해 유도됨)에 미치는 영향은 절제된 해마 조직에서 확립된 유도로 인해 조사되고 있습니다. lowMg2++BIC를 이용한 SL 유도에 대한 예비 결과가 보고되었습니다(그림2),이 데이터의 분석은 여기에 포함되지 않지만.

Representative Results

간질 활성은 최대 15명의 환자에서 유래하는 절제된 인간 해마 조직에서 성공적으로 기록되었습니다. 안정적인 수송 및 준비 절차를 수립하는 것은 인간의 뇌 조직에서 간질 활동의 성공적인 유도에 매우 중요합니다. 최근에 발표된 결과, 1) 상이한 환자의 절제된 조직에서 간질활성의 안정적인 유도를 보였으며, 2) 새로운 항간질기전기전기의 평가를 위한 전임상 도구로절제된 인간 뇌조직을14,,20으로평가하고 있다. highK++4-AP 유도 간질 활성을 몇 분 이내에 버스트 활성형태로 적용한다(도2A,B, C, D). 인간 해마 조직이나 현세엽 간질(TLE)으로 인한 높은 신경 세포 손실로 인해 전극의 배치는 기록 의 시작 부분에서 조절될 수 있다. 10분 후(전극 배치와 무관하게) CA1 영역에서 슬라이스의 버스트 활동이 보이지 않는 경우 슬라이스 생존가능성이 저하될 수 있으며 슬라이스를 교체해야 합니다. SL은 >10s의 지속 기간을 가지며 lowMg2++BIC(도2E,F)의적용으로 유도될 수 있다. 도 2E는 몇 분 후 SL의 안정적인 유도를 나타내며 기록 전반에 걸쳐 안정적인 주파수를 나타낸다. 여기서, SLE 활성은 조사된 환자로부터 4개의 슬라이스 중 2개에서 성공적으로 유도되었다. 한 슬라이스는 SLE 활동 15분 후에만 버스트 활성을 보였고, 다른 슬라이스는 40분 후에도 SLED를 보여주지 않았습니다. 물질 효과의 전임상 평가를 위해, highK++4-AP에 의해 유도된 버스트 활동에 대한 잠재적인 항질 효과. 공지및 잠재적 항질성 물질(lacosamide, DMEA, dynorphine14)이테스트되었으며, DMEA(새로운 잠재적 인 항질 물질)20뿐만아니라 기존의 AED 라코사미드(나트륨 채널 차단제)에 대한 예가 여기에 나와 있다. 라코사미드와 DMEA(그림3C)를적용하는 동안 버스트 이벤트의 이벤트 및 이벤트 간 간격(IEI)의 수는 모두 감소했지만 진폭은 대부분 영향을 받지않았다(도 3D). 슬라이스의 하위 집합에서 버스트 이벤트의 유도가 처음 몇 분 안에 달성되었음에도 불구하고 적용 된 AED에서 세척하는 동안 활동 빈도가 회복되지 않았습니다 (여기에 표시되지 않은 데이터는 Kraus 외20참조). 여기서, 적용된 약물은 효과를 유도하는 것으로 간주되었다; 그러나, 버스트 활동의 감소는 긴 기록 도중 활동의 점진적인 부패에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 따라서 결과를 신중하게 해석해야 합니다. 그림 1: 인터페이스 챔버입니다. 인간 해마 뇌 슬라이스의 저장을 위해, 두 개의 뇌 슬라이스 보유 구획인터페이스 챔버가 사용된다(A); 구체적으로, 하스형 인터페이스챔버(23). 여기서, 해마 뇌 슬라이스는(d)필터 용지의 3층,(e)개별 뇌 슬라이스의 처리를 가능하게 하는 작은 조각, 그리고(f)더 큰 필터 종이 조각을 놓아 슬라이스 아래에 충분한 용액층을 보장한다. (c)필터 용지 위에 뇌 슬라이스를 둘러싼 면현은 구획의(a)상단의 입구에서 균일한 솔루션 흐름을 보장합니다. (b)커버 뚜껑은 구획 아래에서 슬라이스로 산소를 지시합니다. (B) 슬라이스 홀수 1개의 상단 뷰. (C) 필터 용지의 레이어를 설명하는 측면 보기입니다. (g)챔버의 바닥. (h)연동 펌프에 연결된 용액 유입을 위한 튜브(파란색 화살표는 용액 흐름의 방향을 표시). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 도 2: highK++4-AP 및 lowMg2++BIC에 의해 유도된 인간 해마 슬라이스에서 간질 활성. CA1 예제 기록 및 하이K +(8mM)+4-AP(100 μM) 및 (A,B,C,D) lowMg2++BIC(10μM) (E,F) 응용의응용 의 발췌.+ (A) highK++4-AP의 목욕 응용 프로그램은 몇 분 이내에 간질 활성을 유도하고, 활성은 적어도 60 분 동안 안정적이다. (A)의 세부 사항은 (B)에서 볼 수 있습니다. 인간의 해마 슬라이스의 CA1 영역에서 두 가지 유형의 활동이 유도됩니다: 인터ICT와 같은 스파이크(C, [B]의 세부정보) 및 버스트 활동(D, [B]의 세부정보). 버스트 활성은 항간질약물에 민감하게 작용하여 잠재적인 항간질 물질의 효과에 대해 분석된 것으로나타났다(도 3). (E,F) lowMg2++BIC의 적용은 몇 분 이내에 CA1에서 >10 s(F)의기간에 SL을 유도한다. 그러나 SL의 유도는 다른 슬라이스에서 최대 30분이 걸릴 수 있습니다. 스케일 바 = 0.2 mV, 2분(A, E), 5s (B), 500 ms (C, D), 5 분 (E), 2 s (F). 이 수치는 크라우스 외20에서적응되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3: 라코사미드 또는 DMEA를 적용하는 동안 인간 조각의 간질 버스트 활성감소. 버스트 활성은(A)라코사미드 및(B)DMEA, 잠재적인 새로운 항질 성 분자의 적용 중에 감소하였다. (A) 및 (B)는 (C) 및 (D)에서 분석에 사용되는 영역의 발췌와 함께 CA1 영역의 예시적인 기록을 보여준다. 파열 활성은 라코사미드(100 μM) 및 DMEA(10mM) 적용 시 감소하였으며, 중간 발췌에 의해 볼 수 있고 세척 중에 다시 증가합니다. (C,D) 버스트 활성의 수와 진폭은 각 적용 단계(기준선, 라코사미드/DMEA, 세척)의 마지막 5분 동안 분석되었으며, 모든 환자에 대한 요약된 결과(이벤트 수, C; 진폭, D)를 평균 ±SD로 나타내었습니다. 각 점은 한 명의 환자를 나타냅니다. 별표는 라코사미드 응용 프로그램 (*p & 0.05, n = 4)의 분석을위한 Dunnett의 여러 그룹 비교와 프리드먼 테스트 및 포스트 혹에 의해 평가로 상당한 차이를 표시하거나 DMEA 응용 프로그램 (**p & 0.01, n = 10)의 분석을위한 투키의 비교와 반복 측정 ANOVA 및 포스트 혹에 의해. 스케일 바 = 0.2 mV, 2 분 (전체 녹음, A), 5 s (발췌, A), 3 분 (전체 녹음, B), 및 1 s (발췌, B). 이 수치는 크라우스 외20에서적응되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 솔루션 1.1 콜린 aCSF 물질 10배 농도(mM) 1x 농도(mM) 참고 콜린 Cl 1100 110 (+)-나 L-아스코르바테 116 11.6 MgCl2x6H2O 70 7 나 피루바테 31 3.1 KCl 25 2.5 나흐2PO4 12.5 1.25 나코3 260 26 카Cl2 – 0.5 최종 솔루션에 추가 포도 당 – 10 최종 솔루션에 추가 솔루션 1.2 aCSF 물질 10배 농도(mM) 1x 농도(mM) 참고 Nacl 1290 129 나흐2PO4 12.5 1.25 카Cl2 16 1.6 KCl 30 3 MgSO4 18 1.8 포도 당 – 10 최종 솔루션에 추가 솔루션 1.3 highK++4-AP ACSF 물질 10배 농도(mM) 1x 농도(mM) 참고 Nacl 1240 124 나흐2PO4 12.5 1.25 카Cl2 16 1.6 KCl 80 8 MgSO4 18 1.8 포도 당 – 10 최종 솔루션에 추가 4-AP – 0.1 최종 솔루션에 추가 솔루션 1.4 lowMg2++BIC aCSF 물질 10배 농도(mM) 1x 농도(mM) 참고 Nacl 1300 130 나흐2PO4 12.5 1.25 카Cl2 16 1.6 KCl 30 3 포도 당 – 10 최종 솔루션에 추가 빅 – 0.01 최종 솔루션에 추가 솔루션 2 물질 10배 농도(mM) 1x 농도(mM) 참고 나코3 210 21 표 1: 운송, 준비 및 기록을 위한 10배 및 최종 1x 솔루션 준비.

Discussion

살아있는 인간의 뇌 조직은 제대로 그대로 인간의 뇌 마이크로 네트워크를 나타내기 때문에, AEDs의 전임상 평가에 매우 가치있는 도구입니다. 제시된 프로토콜은 AED 평가에 중요한 간질 활성을 위한 고품질 해마 슬라이스뿐만 아니라 안정적인 유도 방법을 보장하는 조직 수송 및 준비를 위한 방법을 설명합니다.

간질 활성뿐만 아니라 인간의 뇌 슬라이스에서 화학적 또는 전기 유도방법에 대한 조사는 이전에 다른그룹(17,,20,,21,,22)에의해 나타내었다. 이 프로토콜은 낮은 Mg 2++BIC의 적용을 통해 CA1 영역에서 SL의 유도뿐만 아니라 높은 K++ 4-AP의 응용 프로그램을 통해 다른 환자에서 슬라이스에서 안정적인 버스트 활동의 유도를 설명합니다. 버스트 활동의 유도가 SLEs(1명의 환자에서 테스트된 슬라이스의 50%)보다 더 일관된 것으로 나타났습니다(1명의 환자에서 테스트된 슬라이스의 50%). 그러나, 지금까지, SLEs의 유도는 단지 한 환자에서 시험되었습니다. 그럼에도 불구하고, SL은 아직 높은 K + +4-AP를 사용하여 유도 할 수 없었기 때문에 낮은 Mg2++ BIC에 의한 SL의 유도가 권장됩니다.

몇몇 연구 결과는 인간 적인 두뇌 조직의 수송 그리고 준비를 위한 방법을 소개하고 수시로 신경 생존에 중요한 3개의 요인을 강조합니다: 수송 시간, 사용된 수송 해결책 및 조건을 저장합니다.

최적의 슬라이스 생존가능성을 위해 일부 그룹은 절제된 뇌 조직의 수송이 가능한 한 짧다고 제안합니다. 그러나 수술실과 실험실은 거의 근접하지 않으므로 긴 운송으로 인해 슬라이스 품질이 저하될 수 있습니다. 일부 그룹은 전송12동안 솔루션에 일정한 O2를 적용하여이 장애물을 극복했습니다. 우리는 짧은 (최대 = 15 분) 및 전송 하는 동안 일정 한 추가 O2 공급 없이 시간의 긴 (최대 = 1 h) 기간에 대 한 뇌 조직을 수송 했다18,,25. 이러한 경우, 조직 품질의 차이는 간질 적정 기록 중에 관찰되지 않았다. 우리 연구소의 다른 그룹과 통신할 때 패치 클램프 실험의 경우 슬라이스 품질도 변하지 않았습니다. 대조적으로, 조직 질의 분산은 아마도 수술 도중 손상에서 유래합니다, 장기간 절제술, 및 슬라이스 절차.

수송 및 절단 용액에 관하여, 모든 게시된 방법은 설치류 패치 클램프 실험을 위한 표준 절차와 유사한 삼투압때문에 세포 팽윤을 감소시키기 위하여 해결책에서 NaCl을 생략합니다. 그러나, 몇몇 대체체는 지금까지 소개되었습니다 (즉, 자당 기반 aCSF13,,22,NMDG 기반 aCSF12,,26,및 콜린 기반 aCSF27). 팅과 동료들은 2014년26년에 슬라이스 준비를 위해 NMDG 기반 aCSF를 도입하고 나중에 복구 프로토콜을 추가하여 SS28에NaCl을 천천히 다시 도입합니다. 그러나, Ting 외.에 의해 설명된 바와 같이, NMDG 기반 aCSF에서 제조된 뇌 조직의 뉴런은 더 높은 막 저항을 나타내며, 따라서 패치 클램프실험(26)의전신 세포 씰에 영향을 미친다. 따라서 NMDG 기반 aCSF에서 콜린 기반 aCSF20의사용으로 전환하여 필드 잠재력과 패치 클램프 레코딩 모두에 고품질 의 조각을 산출합니다.

슬라이스의 저장과 관련하여, 인터페이스 조건이 긴 슬라이스 생존18에중요한 최적의 산소를 제공한다는 것이 일반적으로 허용된다. 그러나, 다른 그룹은 침수조건(12)에서최대 72h의 슬라이스 생존을 보여준다. 이전 가설과는 달리, 인간의 뇌 조각 설치류 조각에 비해 낮은 산소 또는 산화 스트레스에 더 저항 하는 것 같다. 주로, 인터페이스 챔버는 이전에 인간의 해마 슬라이스의 저장에 사용 되었습니다., 비록 침수 조건 패치 클램프 실험에서 인간의 두뇌 조각의 유지 보수에 대 한 것이 좋습니다.

다른 그룹에서 논의한 바와 같이, 긴 슬라이스 생존을 위한 추가 적인 중요한 단계(인터페이스 &48 h18,침수&72 h12)는세균 오염의 예방이다. 설치류 뇌 슬라이스는 전형적으로 최대 8시간 동안 전기생리학적 기록에 사용되며, 세균 오염은 이 기간 동안 슬라이스 생존에 영향을 미치지 않는 것으로 간주되지 않는다. 한 절제술에서 준비 된 슬라이스의 높은 수와 인간의 뇌 조직의 드문 가용성은 인간의 뇌 조각의 생존을 연장 할 필요성을 강조. 이 방법은 성공적으로 쉽게 멸균 조건에 적응 할 수있는 살아있는 인간의 해마 뇌 조각의 준비를 설명합니다. 그러나 여기서 수행된 레코딩의 경우 20h를 연장하는 슬라이스 생존이 우선순위가 아니었습니다.

인터페이스 챔버에서의 레코딩은 또한SLEs(22)와같은 간질 활성을 유도하는 데 필수적인 것으로 나타났다. 낮은 산소로 인해 침수 된 조건은 SLEs의 기록에 거의 사용되지 않습니다. 그러나 패치 클램프 실험에 필요한 광학 고해상도에 필요합니다. 최적화된 침수형 기록 챔버의 사용은 높은 산소화 및 빠른 약물 응용프로그램(29)으로인하여 인간의 뇌 슬라이스에서 간질 편성 활성(세포외 필드 또는 단일 뉴런)의 기록을 가능하게 한다. 여기서, 필드 잠재적 기록에 대한 방법 및 결과를 설명하지만, 패치 클램프 녹음이 수정된 기록 챔버(표시되지 않음)를 사용하여 마우스 및 인간의 뇌 슬라이스에서 성공적으로 수행되었다는 점을 강조해야 한다.

절제된 인간의 뇌 조직은 설치류 모델에 비해 더 높은 번역 값을 갖는다. 그것은 iPSC에 의해 재현될 수 없는 성인, 병은 신경 망을 나타냅니다. 그러나, 어떤 체외 시스템에서와 같이, 인간의 두뇌 조각은 그대로 인간의 두뇌를 나타내지 않습니다. 추가적으로, 절제된 두뇌 조직의 기록된 신경 네트워크는 작동 또는 준비 도중 손상 때문에 상당한 분자 및 기능적인 변경을 겪을 수 있습니다. 슬라이스 절차는 GABAergic 기능에 영향을 미치는 것으로 표시 되었으며 간질 활성30의유도에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 제한은 가설을 공식화하는 동안 고려해야 합니다. 잠재적인 항간질 약물을 테스트할 때, 약물 표적이 모든 인간 뇌 영역 또는 모든 환자에서 표현되지 않을 수 있기 때문에 다른 뇌 영역의 사용을 고려해야합니다. 특히, TLE 환자의 해마는 종종 심한 신경 세포 손실을 동반 해마 경화증의 징후를 보여줍니다. 질병에 대한 잠재적 난치성과 같은 병리학적 변화와 질병 이력에 대한 환자 정보를 얻고 데이터 해석 중에 이를 고려하는 것이 좋습니다.

결론적으로, 이 방법은 성공적으로 간질 활동의 두 가지 유형의 다른 유형을 기록하기위한 살아있는 인간의 해마 뇌 슬라이스 및 유도 기술의 준비를 설명합니다. 살아있는 인간 두뇌 조직의 가용성은 드물기 때문에, 최적화 된 전송 및 기록 조건은 인간의 뇌 조각을 사용하여 실험에서 최대 출력을 보장하기 위해 사용되어야한다. 절제된 인간의 뇌 조직은 설치류 모델 및 세포 배양 실험 이외에 전임상 검증 도구로 사용될 수 있음을 시사한다.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 훌륭한 기술 지원을 위한 맨디 대리석-포터(샤리트-Unversitätsmedizin, 베를린)에게 감사드립니다. P.F.는 독일의 우수 전략-EXC-2049-390688087에 따라 독일 연구 재단(DFG, 도이치 포르스충스게마인샤프트)의 지원을 받았습니다. 이 작품은 베를린 보건 연구소의 생물 의학 연구를 변화시키기위한 QUEST 센터에 의해 지원되었습니다.

Materials

(+)-Na L-ascorbate Sigma Aldrich A4034
4-AP Sigma Aldrich 275875-5G
Blades eliteSERVE GmbH HW3 used for the vibratome
CaCl2 Merck 102382
Choline Cl Sigma Aldrich C1879
Filter paper Tiffen EK1546027T
Gas-tight bottle caps Carl Roth GmbH+Co.KG E694.1
Glass filaments Science Products GB150F-8P for recording electrodes
Glass gas disperser DWK Life Sciences GmbH 258573309
Glucose Sigma Aldrich G7528
Interface Chamber inhouse made – see Haas et al., 1979
KCl AppliChem 131494.1210
Membrane (Cell culture inserts) Merck PICM030050
Membrane chamber inhouse made – see Hill and Greenfield, 2011
MgCl2∙6H2O Carl Roth HNO3.2
MgSO4 Sigma Aldrich M7506
Na pyruvate Sigma Aldrich P8574
NaCl Carl Roth 3957.1
NaH2PO4 Merck 106346
NaHCO3 Carl Roth HNO1.2
Peristaltic pump Gilson Minipuls 3
Slice holder Warner instruments SHD-41/15
Vertical puller Narishige PC-10
Vibratome Leica VT1200S
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Kraus, L., Monni, L., Schneider, U. C., Onken, J., Spindler, P., Holtkamp, M., Fidzinski, P. Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings. J. Vis. Exp. (159), e61085, doi:10.3791/61085 (2020).
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