JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociencias

Подготовка острых человеческих гиппокампа для электрофизиологических записей

Published: May 07, 2020
doi:
10.3791/61085
, , , , , ,
1Department of Neurology with Experimental Neurology,Charité-Universitätsmedizin Berlin, Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 2NeuroCure Cluster of Excellence,Charité-Universitätsmedizin Berlin, Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 3Department of Neurosurgery,Charité-Universitätsmedizin Berlin, Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health

Summary

Представленный протокол описывает транспортировку и подготовку резектированной ткани гиппокампа человека с конечной целью использования жизненно важных ломтиков мозга в качестве инструмента доклинической оценки потенциальных противоэпилептических веществ.

Abstract

Эпилепсия затрагивает около 1% населения мира и приводит к серьезному снижению качества жизни из-за продолжающихся изъятий, а также высокий риск внезапной смерти. Несмотря на обилие доступных вариантов лечения, около 30% пациентов являются лекарственно-устойчивыми. Несколько новых терапевтических средств были разработаны с использованием моделей животных, хотя скорость пациентов с лекарственной устойчивостью остается неизменной. Одной из вероятных причин является отсутствие перевода между моделями грызунов и людей, таких как слабое представление о фармакористству человека в моделях животных. Резекированная ткань мозга человека в качестве инструмента доклинической оценки имеет преимущество, чтобы преодолеть этот переводческий разрыв. Описанный здесь метод для высокого качества подготовки человеческих гиппокампа ломтиками мозга и последующей стабильной индукции эпилептиформной активности. Протокол описывает индукцию активности всплеска при применении 8 мМ ККл и 4-аминопилидина. Эта деятельность чувствительна к установленным AED лакосамиду или новым противоэпилептическим кандидатам, таким как диметилэтаноламин (DMEA). Кроме того, метод описывает индукцию захвата, как события в CA1 человека гиппокампа мозга ломтиками путем сокращения внеклеточного Mg2 “и применение бикукуллина, блокаторрецептора ГАМК. Экспериментальная настройка может быть использована для проверки потенциальных противоэпилептических веществ на их воздействие на эпилептиформную активность. Кроме того, механизмы действия постулируются для конкретных соединений могут быть проверены с помощью этого подхода в тканях человека (например, с помощью патч-зажима записи). В заключение можно сказать, что исследование жизненно важной ткани мозга человека ex vivo (здесь резекция гиппокампа у пациентов, страдающих эпилепсией височной доли) улучшит текущее знание физиологических и патологических механизмов в мозге человека.

Introduction

Эпилепсия является одним из наиболее распространенных неврологических расстройств, затрагивающих 1% населения мира, и связано с повышенной заболеваемостью и смертностью1,2. К сожалению, одна треть пациентов, страдающих эпилепсией, являются лекарственно устойчивыми, несмотря на обилие доступных вариантов лечения, включая более 20 одобренных противоэпилептических препаратов (AEDs)3. Неспособность перевести результаты доклинических исследований на животных к клиническим испытаниям является одной из причин, почему перспективные стратегии лечения не являются эффективными у многих пациентов4. В последнее время нейропептид Y (NPY) и галанин, как было показано, имеют противоэпилептические эффекты в животных моделях; хотя, при тестировании в резектной ткани человеческого мозга, только NPY был эффективен5.

Большинство существующих знаний, касающихся основных неврологических механизмов и подходов к терапии заболеваний, вытекают из моделей животных и экспериментов по клеточной культуре. Хотя эти модели информативны, они представляют собой лишь отдельные аспекты сложных заболеваний человека и сети мозга взрослого человека. Кроме того, ткани мозга человека имеет потенциал для преодоления трансвеститового разрыва, но редко доступны для функциональных исследований. Например, посмертная ткань мозга была ценным инструментом в исследовании экспрессии белка, морфологии мозга, или анатомических связей, хотя нейронная активность часто скомпрометирована это ткань6,7,8,9,10,11.

В отличие от жизни резектной ткани мозга человека была исследована в отношении доклинической оценки наркотиков, основные нейронные функции и модели экспрессии генов12,13,14,15,16,17. Большим преимуществом ломтиков человеческого мозга по сравнению с ломтиками грызунов является длительная жизнеспособность нейронной ткани после резекции и подготовки. По сравнению с ломтиками мозга грызунов, которые обычно могут быть записаны до 8 ч после подготовки, человеческий мозг ломтики показывают стабильную нейрональную активность до 72 ч, что позволяет тщательное исследование этих редких и ценных образцов12,18.

Несколько исследований исследовали свойства эпилептической активности в различных областях резектной корковой и гиппокампальной ткани человека и использовали различные методы для индукции эпилептической активности. В грызунах эпилептиформная активность может быть вызвана несколькими методами: электрическая стимуляция DG hilar клеток, увеличение внеклеточногоK (8-12 мМ KCl), блокированиерецепторов ГАМК по бикукуллину (BIC), блокирование калийных каналов 4-аминоспиридином (4-AP), а также удаление или уменьшение Mg2 в внеклеточном растворе19. Однако индукция эпилептической активности в тканях человека требует сочетания по крайней мере двух вышеупомянутых методов20,,21,,22.

Представлено здесь метод для подготовки человеческого гиппокампа ломтиками мозга, которые являются жизнеспособными до 20 ч и показать индукции эпилептиформной активности при применении высокогоK (8 мМ) и 4-AP или низкий Mg2 “и BIC.

Protocol

Пациенты должны дать информированное письменное согласие до операции, и необходимые этические соглашения должны быть на месте до начала эксперимента. Что касается репрезентативных результатов, то все исследования с участием людей-участников были рассмотрены и одобрены Шарите-Университетом-межедизином, Берлин (EA2/111/14). 1. Подготовка 10x решений ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за трудностей в планировании доступа к ткани мозга человека, рекомендуется подготовить 10x решения, как описано здесь. Кроме того, окончательные 1x решения могут быть приготовлены заново путем добавления отдельных веществ в конечной концентрации в двойной дистиллированной воды (ddH2O). Для отдельных 10x растворов, добавить вещества в ddH2O в соответствии с таблицей 1 и перемешать до растворения. Используйте 10x растворы до 1 месяца после приготовления (до 1 года для замороженных 10x холина aCSF). Для 10x холина aCSF, подготовить 50 мл aliquots 10x 1.1 холина aCSF (Таблица 1) и заморозить при -20 градусов по Цельсию или -80 градусов по Цельсию до дальнейшего использования.ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте глюкозу и CaCl2 до 10x 1.1 холина aCSF для предотвращения загрязнения бактериями и осадков карбоната кальция. 10x решение 2 может быть использовано для всех 1x окончательных решений, в то время как 10x решения 1.1-1.4 настроены и названы соответственно (Таблица 1). 2. Подготовка 1x окончательных решений ПРИМЕЧАНИЕ: Заключительные 1x решения должны быть подготовлены свежие или ранние, насколько это возможно за день до использования. Все окончательные решения должны быть карбогенированы с 5% CO2 и 95% O2 с помощью разострителя стеклянного газа, чтобы обогатить растворы с кислородом, и настроить рН до 7,4 (максимум 7,4 й 0,2). Холин aCSF для транспортировки и подготовки Для окончательного решения 500 мЛ, оттепель 50 мл aliquot 10x раствор 1.1 aliquot для холина aCSF в 37 кковая ванна. Добавьте оттаяемый 50-мл аликот 10x раствор 1.1 и 50 мл 10x раствор 2 до приблизительно 300 мл ddH2O. Добавьте окончательные концентрации глюкозы и CaCl2, затем перемешайте до растворения(Таблица 1, раствор 1.1). Добавьте ddH2O к окончательному объему 500 мл и измерьте осмолалярность (300 м м и 10 мсм). Дополнительно используйте фильтр для стерилизации решения (см. обсуждение о жизнеспособности длительного среза в стерильных условиях). Заполните отдельную бутылку примерно 100 мЛ 1x холина aCSF для транспортировки из операционный зал в лабораторию. Дополнительно: в зависимости от времени транспортировки из операционный зал в лабораторию, рассмотреть вопрос об использовании газонепроницаемых колпачков бутылки для обеспечения стабильного рН aCSF в течение более длительных периодов транспортировки. Храните окончательное решение при цене 4-8 градусов до дальнейшего использования. В день работы, озноб 1x холина aCSF на льду и карбогенат, по крайней мере 10-15 мин с помощью стеклоораспределителя газа подключен к карбогенового газа (5% CO2, 95% O2).ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрите возможность переноса газового баллона в операционный зал в случае более длительного времени ожидания, что потребует повторного карбогенизации транспортного решения. Тем не менее, мы перевозили гиппокампа ткани без повторного карбогенации в течение длительного времени транспортировки (15 мин против 60 мин) и не наблюдали различий в индукции эпилептиформной активности. aCSF для хранения и записи Для окончательного решения 2 л, добавить 200 м л 10x раствор 1.2 (aCSF) и 200 м л 10x раствор 2 и глюкозы (Таблица 1) до 1500 м л ddH2O.ПРИМЕЧАНИЕ: Объемы окончательных решений зависят от прикладных экспериментов и типа камеры, используемой для хранения и записи. Добавьте ddH2O к окончательному объему 2 л и измерьте осмолячность (300 м/10 мсм). Предварительно разогрейте раствор до 35 градусов по Цельсию и карбогената в течение по крайней мере 10-15 мин перед использованием. HighKNo4-AP aCSF для индукции всплеска активности Для окончательного решения 1 л, добавить 100 м Л 10x раствор 1.3 (высокий 00й4-AP aCSF) и 100 м л 10x раствор 2 до 700 м л ddH2O. Добавить глюкозу и 4-AP (окончательная концентрация 100 мкм) в соответствии с таблицей 1. Добавьте ddH2O к окончательному объему 1 л и измерьте осмолячность (300 м/10 м/м). Предварительно разогрейте раствор до 35 градусов по Цельсию и карбогената в течение по крайней мере 10-15 мин перед использованием. LowMg2 “BICaCSF для индукции захвата, как события (SLEs) Для окончательного 1 L решения, добавить 100 м Л 10x решение 1.4 (низкийMg2 “BICaCSF) и 100 м л 10x раствор 2 до 700 мл ddH2O. Добавить глюкозу и BIC (окончательная концентрация 10 мкм) в соответствии с таблицей 1. Добавьте ddH2O к окончательному объему 1 л и измерьте осмолячность (300 м/с и 10 мсм). Предварительно разогрейте раствор до 35 градусов по Цельсию и карбогената в течение по крайней мере 10-15 мин перед использованием. 3. Подготовка интерфейсной камеры В интерфейсной камере ломтики опираются на три слоя фильтровальной бумаги, чтобы обеспечить достаточное количество раствора под срезом. Для этого вырежьте два кусочка фильтровальной бумаги на 4 х х 2 см для каждого отсека-удержания (описанная интерфейсная камера состоит из двух отсеков) и поместите их друг на друга. Поместите тонкие хлопчатобумажные струны вокруг фильтровальных бумаг 4 см х 2 см внутри отсеков, чтобы снять напряжение раствора. Убедитесь, что даже поток (здесь, черные нейлоновые колготки сократить до тонкой вырезать строки 10 см в длину используются; для размещения, см. Рисунок 1). Поместите небольшие кусочки фильтровальной бумаги поверх больших фильтровальных бумаг внутри отсеков, держащих срез. Мелкие кусочки ткани фильтра должны быть примерно размером с один ломтик мозга (1,5 см х 1,0 см) и позволит дальнейшее обращение с отдельными ломтиками. Поместите от трех до четырех небольших кусочков фильтровальной бумаги в каждый отсек. Обеспечить скорость потока aCSF 1,8 м/мин с перистальтическим насосом. Карбогенетическая и преуменная интерфейсная камера до 35 градусов по Цельсию (окончательная температура среза должна быть 32 градусов по Цельсию). 4. Настройка зоны подготовки ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка может быть выполнена в стерильных условиях, чтобы избежать загрязнения и удлинения ломтик выживания. Однако не все вибромы помещаются под стерильный капюшон, и необходимы другие меры для уменьшения загрязнения во время подготовки. В этом разделе описываются некоторые из этих мер. Протрите область приготовления с 70% EtOH и место либо алюминиевой фольги или стерильных крышки на верхней части области. Приготовьте суперклейт, два острых пинцета, шпатель, скальпель с лезвиями и лезвие для грубой резки мозговой ткани. Инструменты могут быть стерилизованы до процедуры для уменьшения загрязнения. Протрите буферный лоток и образец пластины вибратоми с 70% EtOH. После того, как буферный лоток полностью высохнет, накройте его алюминиевой фольгой и поместите лоток в ледяную ванну. Заполните ледяную ванну дробленым льдом и держите при -20 градусов до подготовки. Протрите вибратом и лезвие бритвы с 70% EtOH и калибровать вибратом, чтобы свести к минимуму вертикальные вибрации и повреждения тканей во время процедуры нарезки. 5. Нарезка тканей и хранение Непосредственно после резекции, поместите ткани сразу в холодный, карбогенированный холин aCSF и быстро транспортируйте в лабораторию.ВНИМАНИЕ: Носите перчатки и маску для лица во время подготовки, так как ткани мозга человека могут содержать потенциальные патогены. Кроме того, ношение маски для лица при неработочащем под стерильным капюшоном значительно снизит загрязнение растворов и тканей мозга. Удалить ткани из холина aCSF и отрезать любые сожгли части ткани. Вырезать ровную поверхность, чтобы клей кусок ткани на образец пластины, при рассмотрении угла резки и ткани слоев. В идеале, гиппокамп ломтик содержит DG, CA1-4, и (по возможности) subiculum. Нарежьте ткань мозга на 400 мкм толщиной ломтиками и отрегулируйте амплитуда и скорость во время резки. Из-за возможного оставшегося пиа-матер, ткани мозга человека показывает больше сопротивления и может потребоваться медленнее резки.ПРИМЕЧАНИЕ: Толщина фрагмента сильно влияет либо на доступную сеть (больше нейронов в более толстых ломтиках), либо на жизнеспособность среза (проникновение раствора в срез). Мы использовали 500 мкм ломтиков для увеличения потенциально доступной микросети, и не могли наблюдать различия в индукции эпилептической активности. 300 ломтиков мкм обычно используются для экспериментов патч-зажим, хотя индукция эпилептической активности в этих ломтиков еще не были протестированы здесь. Мы используем 400 мкм в качестве стандартной толщины ломтика, хотя 300-500 мкм ломтиков может быть достаточно. Перед сбором используйте скальпель, чтобы уменьшить размеры ломтиков мозга, чтобы вписаться в камеру записи. Для использования мембранной камеры (см. раздел 6) ломтики должны быть максимально 1,5 см х 1 см. При уменьшении, рассмотреть конкретные слои и соединения должны быть нетронутыми для записи (например, для записи в CA1 и DG, отрезать subiculum и окружающие белые ткани). Используя шпатель и небольшие щипцы, тщательно поместите ломтики в камеру интерфейса на небольшие фильтрующие бумаги и дайте им отдохнуть за 1 ч в aCSF до записи. Срезы могут быть записаны до 20 ч (даже дольше, когда в стерильных условиях). 6. Запись эпилептической активности В мембранной камере (погруженная камера записи типа) поместите ломтик мозга на прозрачную полупрозрачную мембрану, которая приклеена к пластиковому кольцу24. Для этого используйте супер клей, чтобы прикрепить пластиковое кольцо к мембране вставки клеточной культуры. Используйте скальпель, чтобы удалить любую мембрану на внешней стороне пластикового кольца. Убедитесь, что мембрана ровная и полностью прикрепленная к кольцу перед размещением мембраны в камере.ПРИМЕЧАНИЕ: Мембрана может храниться в ddH2O при 4-8 градусов по Цельсию и повторном повторном повторном повторном хранении до 1 месяца. Держите мембрану влажной во все времена. Как приток, так и отток мембранной камеры соединены с трубками для подачи раствора. Поместите трубки в перистальтический насос так, чтобы приток и отток двигались в противоположных направлениях. Поместите трубку притока и оттока в карбогенированную, передогела aCSF до тех пор, пока все трубки и камера не будут заполнены раствором. Отрегулируйте скорость перистальтического насоса, чтобы достичь равномерной скорости потока 10-13 м/мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Мембранная камера, используемая здесь, представляет собой высокую скорость потока, подводную камеру записи типа, позволяющую поток раствора до 14 м/мин24. В случае использования другой камеры записи подводного типа необходимо скорректировать скорость потока. Однако для индукции эпилептической активности настоятельно рекомендуется использовать мембранную камеру. Используйте нагревательный элемент, подключенный к притоку в непосредственной близости от мембранной камеры, чтобы обеспечить стабильную температуру 32 градусов по Цельсию. Приготовьте 1-2 MΩ стеклянные пипетки с помощью вертикального шкива. Заполните пипетки 154 мМ РастворОм NaCl и поместите их в держатель электрода. Используя пинцет и шпатель, удалите гиппокампа ломтик из интерфейса камеры, взяв ломтик с небольшой фильтровальной бумагой и размещение как в чашке Петри заполнены карбогенированной aCSF. Удалите небольшую фильтровальную бумагу из ломтика гиппокампа и (при необходимости) примените силу с помощью пипетки, чтобы отделить ломтик от фильтровальной бумаги. Будьте осторожны, чтобы не перевернуть ломтик. Поместите срез в камеру записи и удерживайте его на месте с помощью срезовой сетки.ПРИМЕЧАНИЕ: В силу принципа Бернулли, в используемой мембранной камере погруженного типа, ломтики обычно стабильны без использования дополнительной сетки. Поместите электроды в области и слой интереса (здесь, CA1) и начать запись. Запись потенциальной активности поля в текущем режиме зажима со скоростью выборки 10-20 кГц и низкой частотой фильтрации на 2 кГц. Запись базальной активности в ACSF на срок до 5 мин. Переключите потоковые трубки с aCSF на highK-4AP или lowMg2″(BIC aCSF) и трубку оттока в контейнер для отходов, чтобы предотвратить смешивание растворов. После 2 мин поместите трубку оттока в тот же раствор, что и приток для сохранения раствора. Активность взрывов, вызванная высокимуровнем4-AP, должна быть видна через 2-5 мин после мытья. Тем не менее, индукция SLEs lowMg2 “BICможет занять до 30 мин. При необходимости тщательно меняйте положения электродов, чтобы получить оптимальные результаты. Оказавшись в конечной позиции, зафиксив базовую активность не менее 20 минут. Если вы записываете SLEs, рассмотрим более длинные базовые записи из-за низкой частоты SLEs. В случае, если базовая активность стабильна (плато частоты событий), мыть в нужном препарате. Обратите внимание, что из-за высокой скорости потока мыть в наркотики занимает всего 2-5 мин, что позволяет быстро обмена растворов. Запись активности во время применения препарата, по крайней мере 20 мин, после промывания. Активность должна быть стабильной, по крайней мере 60-90 мин, что позволяет более длительные записи. 7. Анализ Анализ частоты и амплитуды может быть выполнен с помощью любого доступного программного обеспечения. До сих пор мы не смогли установить надежный автоматический анализ SLEs или взрыв активности, а вместо этого использовали полуавтоматический анализ с визуальным подтверждением выявленной активности. Активность взрыва характеризуется двухфазным, положительным и отрицательным отклонением и продолжительностью 100 мс. Все события, визуально определяемые как активность всплеска (например, полуавтоматический пороговый анализ), должны быть указаны вручную для дальнейшего анализа частоты событий (интервал межсобытия, IEI), амплитуды и общего количества событий в течение исследуемого периода времени.ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за высокой частоты всплеска активности, последние 5 минут каждого этапа применения, как правило, анализируется20. SLEs могут быть проанализированы, как описано в Heuzeroth et al. Идентифицированные SLEs могут быть дополнительно проанализированы для продолжительности, амплитуды, частоты шипов и продолжительности тонизирующего (высокочастотного пикирования) против клонической (низкочастотных пиков) продолжительности фазы. SLEs, которые являются йтл;10 с в продолжительности должны быть исключены из анализа.ПРИМЕЧАНИЕ: Для доклинической оценки возможных противоэпилептических веществ, воздействие на активность всплеска (индуцированной highKNo4AP) в настоящее время изучается, в связи с установленным индукции в резектированных гиппокампа ткани. Предварительные результаты по индукции SLEs с использованием lowMg2 “BICбыли зарегистрированы(Рисунок 2), хотя анализ этих данных не включен здесь.

Representative Results

Эпилептическая активность была успешно зарегистрирована в резектированной ткани гиппокампа человека, происходящих из до 15 пациентов. Установление стабильных транспортных и подготовительных процедур имеет решающее значение для успешной индукции эпилептической активности в тканях мозга человека. Недавно опубликованные результаты показали 1) стабильную индукцию эпилептической активности в резектированной ткани различныхпациентов,а также 2) использование резектной ткани мозга человека в качестве доклинического инструмента для оценки новых противоэпилептических механизмов14,20. Применение highKNo4-AP индуцированной эпилептической активности в виде всплеска активности в течение нескольких минут(Рисунок 2A,B,C,D). Из-за низкого распределения нейронов в ткани гиппокампа человека или высокой потери нейрональных клеток из-за эпилепсии височной доли (TLE), размещение электродов может быть скорректировано в начале записи. В тех случаях, когда активность всплеска ломтиков не видна в области CA1 после 10 мин (независимо от размещения электродов), жизнеспособность среза может быть скомпрометирована, и срез должен быть заменен. SLEs, с продолжительностью йgt;10 s, может быть индуцирован с применением lowMg2 “BIC(Рисунок 2E,F). Рисунок 2E показывает стабильную индукцию SLEs через несколько минут и стабильную частоту на протяжении всей записи. Здесь активность СКВ была успешно вызвана двумя из четырех ломтиков исследуемого пациента. Один срез показал только всплеск активности после 15 мин активности SLE, в то время как другой срез не показал SLEs даже после 40 мин. Для доклинической оценки воздействия на вещество было исследовано потенциальное противоэпилептическое воздействие на активность всплеска, вызванную высокимзначением4-AP. Известные и потенциальные противоэпилептические вещества (лакосамид, DMEA, динорфин14) были протестированы, и примеры показаны здесь для обычных AED лакосамид (блокатор канала натрия), а также DMEA (новый потенциал противоэпилептического вещества)20. Количество событий и межсобытийный интервал (IEI) событий всплеска уменьшились как при применении лакосамида, так и DMEA(рисунок 3C),хотя амплитуды в основном не затрагивались(Рисунок 3D). В подмножестве ломтиков, даже если индукция всплеска событий была достигнута в первые несколько минут, частота активности не восстановить во время мытья из прикладных AEDs (данные не показаны здесь, см. Kraus et al.20). Здесь считалось, что применяемые препараты вызывают эффекты; однако на снижение активности всплеска, возможно, повлияло постепенное снижение активности во время длительных записей. Таким образом, результаты должны быть тщательно интерпретированы. Рисунок 1: Интерфейсная камера. Для хранения человеческих гиппокампа ломтиками мозга используется интерфейсная камера с двумя отсеками для удержания ломтика мозга(A); в частности, haas типа интерфейс камеры23. Здесь, гиппокампа ломтиками мозга опираться на(г) три слоя фильтровальной бумаги, (е) меньшие куски, чтобы обработка отдельных ломтиков мозга, и (F) больше фильтр бумажных частей для обеспечения достаточного слоя раствора ниже ломтика. cc) Хлопчатобумажная строка, окружающая ломтики мозга, поверх фильтрующих бумаг, обеспечивает равномерное поступление раствора из заливов вверхнейчасти отсека. ( б)Крышка крышки направляет кислорода из-под отсека на ломтик. (B) Вид сверху одного отсека для удержания среза. (C) Боковой вид для иллюстрации слоев фильтрующих бумаг. g) Нижняя часть камеры. (h)Труба для притока раствора, который подключен к перистальтическому насосу (синие стрелки отмечают направление потока раствора). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2: Эпилептиформная активность в человеческих гиппокампах, вызванных высокимуровнем4-AP и lowMg2 “BIC. Ca1 пример записи и выдержки из применения highK(8 мМ) -4-AP (100 мМ) (A,B,C,D) и lowMg2 “BIC(10 мМ) (E, F). (A) Применение ванны highKNo4-AP индуцирует эпилептическую активность в течение нескольких минут, и активность стабильна, по крайней мере 60 мин. Подробная информация о (A) можно увидеть в (B). Два различных вида деятельности индуцируются в области CA1 человеческих ломтиков гиппокампа: межокально-подобные шипы (C, детали«B») и всплеск активности (D, детали«B»). Было показано, что активность взрыва чувствительна к противоэпилептическим препаратам и поэтому анализируется на эффект потенциальных противоэпилептических веществ(рисунок 3). (E,F) Применение lowMg2 “BICиндуцирует SLEs на продолжительность йgt;10 s(F) в CA1 в течение нескольких минут. Тем не менее, индукция SLEs может занять до 30 минут в других ломтиков. Шкала баров 0,2 мВ, 2 мин (A,E), 5 с (B), 500 мс (C,D), 5 мин (E) и 2 с (F). Эта цифра была адаптирована из Kraus et al.20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3: Снижение эпилептической активности всплеска человеческих ломтиков при применении лакосамида или DMEA. Взрыв активность снизилась во время применения ()лакосамид и (B) DMEA, потенциально новой противоэпилептической молекулы. (A) и (B) показывают примерные записи области CA1 с выдержками регионов, используемых для анализа в (C) и (D). Активность взрыва снизилась во время применения лакосамида (100 МКМ) и DMEA (10 мМ), как видно из средних выдержек и снова увеличивается во время промывания. (C,D) Количество и амплитуда всплеска активности были проанализированы за последние 5 минут каждого этапа применения (базовый, лакосамид / DMEA, вымыть) и показано как обобщенные результаты для всех пациентов (количество событий, C; амплитуда, D) в качестве среднего SD. Каждая точка указывает на одного пациента. Звездочки отмечают значительные различия, оцениваемые либо тестом Фридмана, либо пост-специальным с множественным сравнением групп Даннетта для анализа применения лакосамида (0,05, n 4) или повторным измерением ANOVA и пост-специальным с сравнением Туки для анализа приложения DMEA (0,01, n й 10). Масштабные бары 0,2 мВ, 2 мин (полная запись, A), 5 с (выдержки, A), 3 мин (полная запись, B) и 1 с (выдержки, B). Эта цифра была адаптирована из Kraus et al.20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры. Решение 1.1 холина aCSF Вещества 10x концентрация (mM) 1x концентрация (mM) Примечание Холин Cl 1100 110 (К)-На L-аскорбат 116 11.6 MgCl2x6H2O 70 7 На пирувате 31 3.1 Kcl 25 2.5 NaH2PO4 12.5 1.25 NaHCO3 260 26 CaCl2 – 0.5 добавить к окончательному решению Глюкозы – 10 добавить к окончательному решению Решение 1.2 aCSF Вещества 10x концентрация (mM) 1x концентрация (mM) Примечание Nacl 1290 129 NaH2PO4 12.5 1.25 CaCl2 16 1.6 Kcl 30 3 MgSO4 18 1.8 Глюкозы – 10 добавить к окончательному решению Решение 1.3highK Вещества 10x концентрация (mM) 1x концентрация (mM) Примечание Nacl 1240 124 NaH2PO4 12.5 1.25 CaCl2 16 1.6 Kcl 80 8 MgSO4 18 1.8 Глюкозы – 10 добавить к окончательному решению 4-AP – 0.1 добавить к окончательному решению Решение 1.4lowMg2 Вещества 10x концентрация (mM) 1x концентрация (mM) Примечание Nacl 1300 130 NaH2PO4 12.5 1.25 CaCl2 16 1.6 Kcl 30 3 Глюкозы – 10 добавить к окончательному решению Bic – 0.01 добавить к окончательному решению Решение 2 Вещества 10x концентрация (mM) 1x концентрация (mM) Примечание NaHCO3 210 21 Таблица 1: Подготовка 10x и заключительных 1x решений для транспортировки, подготовки и записи.

Discussion

Проживающая резектированная ткань человеческого мозга является очень ценным инструментом в доклинической оценке AEDs, так как она правильно представляет собой неповрежденную микросетю человеческого мозга. Представленный протокол описывает метод транспортировки тканей и подготовки, который обеспечивает высокое качество гиппокампа ломтиками, а также стабильный метод индукции эпилептиформной деятельности, критически важной для оценки AED.

Исследование эпилептической активности, а также методы химической или электрической индукции в человеческих ломтиках мозга ранее были показаны другими группами17,,20,,21,22. Этот протокол описывает индукцию стабильной активности всплеска в ломтиках от разных пациентов с помощью применения высокой KNo4-AP, а также индукции SLEs в области CA1 с помощью применения низкого Mg2“BIC. Выяснилось, что индукция всплеска активность более последовательна (80% проверенных ломтиков у 15 пациентов), чем индукция SLEs (50% проверенных ломтиков у одного пациента). Однако до сих пор индукция СЛЭ была просеислана только у одного пациента. Тем не менее, индукция SLEs низким Mg2 “BICрекомендуется, так как SLEs еще не удалось быть индуцированных с использованием высоких KNo4-AP.

В ряде исследований внедрены методы транспортировки и подготовки тканей мозга человека и часто выделяются три фактора, критически важные для выживания нейронов: время транспортировки, использованные транспортные решения и условия хранения.

Для оптимальной жизнеспособности среза некоторые группы предполагают, что транспортировка резектированной ткани мозга будет как можно короче. Тем не менее, операционные комнаты и лаборатории редко находятся в непосредственной близости, а это означает, что качество среза может быть поставлено под угрозу из-за длительной транспортировки. Некоторые группы преодолели это препятствие, применяя постоянную O2 к решению во время транспортировки12. Мы перевезли ткани мозга для краткости (максимум 15 мин) и длинных (до 1 ч) периодов времени без постоянного дополнительного O2 поставки во время транспортировки, как и другие группы18,25. В этих случаях различия в качестве тканей не наблюдались во время эпилептической записи. В общении с другими группами в нашем институте качество среза не изменилось и для экспериментов патч-зажима. В отличие от этого, дисперсия в качестве ткани, возможно, проистекает из повреждений во время операций, длительной резекции и процедуры нарезки.

Что касается транспортного и режущего раствора, то все опубликованные методы опускают NaCl из растворов для уменьшения отеков клеток из-за осмотического давления, аналогичного стандартной процедуре для экспериментов грызунов патч-зажима. Тем не менее, несколько заменителей были введены до сих пор (т.е., сахароза на основе aCSF13,22, NMDG основе aCSF12,26, и холин основе aCSF27). Тинг и его коллеги представили ACSF на основе NMDG для подготовки крезов в 201426 году, а затем добавили протокол восстановления, который медленно возвращает NaCl к ломтикам28. Однако, как описано Ting et al., нейроны ткани мозга, подготовленные в NMDG на основе aCSF, показывают более высокую мембранную устойчивость, тем самым влияя на цельноклеточную печать во время экспериментовпатч-зажима 26. Таким образом, мы перешли от NMDG основе aCSF к использованию холина основе aCSF20, который дает высокое качество ломтиками для обоих полевых потенциальных и патч-зажим записей.

Что касается хранения ломтиков, общепризнано, что условия интерфейса обеспечивают оптимальную оксигенацию, критическую для выживания длинного ломтика18. Тем не менее, другие группы показывают срез выживания до 72 ч в условиях погружения12. Вопреки предыдущей гипотезе, человеческий мозг ломтиками, как представляется, более устойчивы к низкой оксигенации или окислительного стресса по сравнению с грызунами ломтиками. В первую очередь, интерфейс камеры ранее были использованы для хранения человеческих гиппокампа ломтиками, хотя подводные условия рекомендуется для поддержания человеческого мозга ломтиками в патч-зажим экспериментов.

Как обсуждается другими группами, дополнительным важным шагом для выживания длинного ломтика (интерфейс для хтт;48 ч18, погруженный в воду для хтт;72 ч12) является профилактика бактериального загрязнения. Грызун ломтики мозга, как правило, используются в электрофизиологических записей до 8 ч, и бактериальное загрязнение не считается повлиять на жизнеспособность ломтик в течение этого периода. Большое количество ломтиков, приготовленных из одной резекции и необычная доступность тканей мозга человека, подчеркивает необходимость продления жизнеспособности ломтиков человеческого мозга. Этот метод успешно описывает подготовку живых человеческих гиппокампа ломтиками мозга, которые могут быть легко адаптированы к стерильным условиям. Тем не менее, для записей, выполненных здесь, срез выживания расширения 20 ч не было приоритетом.

Запись в интерфейсных камерах также была показана как необходимая для индукции эпилептической активности, такой как SLEs22. Подводные условия, из-за низкой оксигенации, редко используются для записи SLEs; однако, они необходимы для оптического высокого разрешения, необходимого для экспериментов патч-зажима. Использование оптимизированной камеры записи подводного типа позволяет записывать эпилептиформную активность (внеклеточное поле или один нейрон) в ломтиках мозга человека, из-за высокой оксигенации и быстрого применения препарата29. Здесь описаны методы и результаты для полевых потенциальных записей, но следует подчеркнуть, что записи патч-зажима были успешно выполнены в мышиных и человеческих ломтиков мозга с помощью этой модифицированной камеры записи (данные не показаны).

Резектированная ткань мозга человека имеет более высокую трансляционную ценность по сравнению с моделями грызунов. Она представляет собой взрослую, заболеную нейронную сеть, которая не может быть воспроизведена iPSCs. Однако, как и в любой системе in vitro, ломтики человеческого мозга не представляют собой нетронутый человеческий мозг. Кроме того, зарегистрированные нейронные сети резектной ткани мозга могут подвергаться существенным молекулярным и функциональным изменениям из-за повреждения во время операции или подготовки. Сообщалось, что процедуры нарезки влияют на функцию ГАМК и могут повлиять на индукцию эпилептической активности30. Эти ограничения следует учитывать при разработке гипотезы. При тестировании потенциальных противоэпилептических препаратов следует учитывать использование различных областей мозга, поскольку целевые показатели по лекарственным средствам могут быть выражены не во всех областях мозга человека или у всех пациентов. В частности, гиппокамп пациентов TLE часто проявляют признаки гиппокампа склероз сопровождается тяжелой потерей нейрональных клеток. Рекомендуется получать информацию о патологических изменениях и истории заболеваний, таких как потенциальная огнеупорная по отношению к лекарствам, и учитывать это при интерпретации данных.

В заключение, этот метод успешно описывает подготовку живых человеческих гиппокампа ломтиками мозга и индукционные методы для записи двух различных типов эпилептиформной активности. Поскольку наличие живой ткани мозга человека встречается редко, оптимизированные условия транспортировки и записи должны использоваться для обеспечения максимального результата от экспериментов с использованием ломтиков человеческого мозга. Предполагается, что резецированная ткань мозга человека может быть использована в качестве доклинического инструмента проверки в дополнение к моделям грызунов и экспериментам по культуре клеток.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Мэнди Марблер-Пюттер (Charite-Unversit’tmedizin, Берлин) за отличную техническую помощь. P.F. финансировался Немецким исследовательским фондом (DFG, Deutsche Forschungsgemeinschaft) в рамках стратегии передового опыта Германии-EXC-2049-390688087. Эта работа была поддержана Центром КЕСИТ для преобразования биомедицинских исследований в Берлинском институте здравоохранения.

Materials

(+)-Na L-ascorbate Sigma Aldrich A4034
4-AP Sigma Aldrich 275875-5G
Blades eliteSERVE GmbH HW3 used for the vibratome
CaCl2 Merck 102382
Choline Cl Sigma Aldrich C1879
Filter paper Tiffen EK1546027T
Gas-tight bottle caps Carl Roth GmbH+Co.KG E694.1
Glass filaments Science Products GB150F-8P for recording electrodes
Glass gas disperser DWK Life Sciences GmbH 258573309
Glucose Sigma Aldrich G7528
Interface Chamber inhouse made – see Haas et al., 1979
KCl AppliChem 131494.1210
Membrane (Cell culture inserts) Merck PICM030050
Membrane chamber inhouse made – see Hill and Greenfield, 2011
MgCl2∙6H2O Carl Roth HNO3.2
MgSO4 Sigma Aldrich M7506
Na pyruvate Sigma Aldrich P8574
NaCl Carl Roth 3957.1
NaH2PO4 Merck 106346
NaHCO3 Carl Roth HNO1.2
Peristaltic pump Gilson Minipuls 3
Slice holder Warner instruments SHD-41/15
Vertical puller Narishige PC-10
Vibratome Leica VT1200S
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Hirtz, D., et al. How common are the “common” neurologic disorders. Neurology. 68 (5), 326-337 (2007).
  2. Ngugi, A. K., Bottomley, C., Kleinschmidt, I., Sander, J. W., Newton, C. R. Estimation of the burden of active and life-time epilepsy: a meta-analytic approach. Epilepsia. 51 (5), 883-890 (2010).
  3. Kwan, P., Brodie, M. J. Early Identification of Refractory Epilepsy. New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).
  4. Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
  5. Ledri, M., et al. Differential Effect of Neuropeptides on Excitatory Synaptic Transmission in Human Epileptic Hippocampus. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 35 (26), 9622-9631 (2015).
  6. Qi, X. R., et al. Alterations in the steroid biosynthetic pathways in the human prefrontal cortex in mood disorders: A post-mortem study. Brain Pathology. 28 (4), 536-547 (2018).
  7. Verwer, R. W. H., et al. Post-mortem brain tissue cultures from elderly control subjects and patients with a neurodegenerative disease. Experimental Gerontology. 38 (1-2), 167-172 (2003).
  8. Verwer, R. W. H., et al. Cells in human postmortem brain tissue slices remain alive for several weeks in culture. FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (1), 54-60 (2002).
  9. Le Maître, T. W., Dhanabalan, G., Bogdanovic, N., Alkass, K., Druid, H. Effects of Alcohol Abuse on Proliferating Cells, Stem/Progenitor Cells, and Immature Neurons in the Adult Human Hippocampus. Neuropsychopharmacology. 43 (4), 690-699 (2018).
  10. Dennis, C. V., Suh, L. S., Rodriguez, M. L., Kril, J. J., Sutherland, G. T. Human adult neurogenesis across the ages: An immunohistochemical study. Neuropathology and Applied Neurobiology. 42 (7), 621-638 (2016).
  11. Verwer, R. W. H., et al. Mature astrocytes in the adult human neocortex express the early neuronal marker doublecortin. Brain. 130 (12), 3321-3335 (2007).
  12. Ting, J. T., et al. A robust ex vivo experimental platform for molecular-genetic dissection of adult human neocortical cell types and circuits. Scientific Reports. 8 (1), 8407 (2018).
  13. Le Duigou, C., et al. Imaging pathological activities of human brain tissue in organotypic culture. Journal of Neuroscience Methods. 298, 33-44 (2018).
  14. Agostinho, A. S., et al. Dynorphin-based “release on demand” gene therapy for drug-resistant temporal lobe epilepsy. EMBO molecular medicine. 11 (10), 9963 (2019).
  15. Hodge, R. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
  16. Beaulieu-Laroche, L., et al. Enhanced Dendritic Compartmentalization in Human Cortical Neurons. Cell. 175 (3), 643-651 (2018).
  17. Sandow, N., et al. Drug resistance in cortical and hippocampal slices from resected tissue of epilepsy patients: no significant impact of p-glycoprotein and multidrug resistance-associated proteins. Frontiers in Neurology. 6, 30 (2015).
  18. Wickham, J., et al. Prolonged life of human acute hippocampal slices from temporal lobe epilepsy surgery. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
  19. Avoli, M., Jefferys, J. G. R. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. , (2015).
  20. Kraus, L., et al. Dimethylethanolamine Decreases Epileptiform Activity in Acute Human Hippocampal Slices in vitro. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 209 (2019).
  21. Antonio, L. L., et al. In vitro seizure like events and changes in ionic concentration. Journal of Neuroscience Methods. , (2016).
  22. Gabriel, S., et al. Stimulus and Potassium-Induced Epileptiform Activity in the Human Dentate Gyrus from Patients with and without Hippocampal Sclerosis. Journal of Neuroscience. 24 (46), 10416-10430 (2004).
  23. Haas, H. L., Schaerer, B., Vosmansky, M. A simple perfusion chamber for the study of nervous tissue slices in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 1 (4), 323-325 (1979).
  24. Hill, M. R. H., Greenfield, S. A. The membrane chamber: a new type of in vitro recording chamber. Journal of neuroscience methods. 195 (1), 15-23 (2011).
  25. Andersson, M., et al. Optogenetic control of human neurons in organotypic brain cultures. Scientific Reports. 6, 24818 (2016).
  26. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in molecular biology. 1183, 221-242 (2014).
  27. Testa-Silva, G., et al. Human synapses show a wide temporal window for spike-timing-dependent plasticity. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 2, 12 (2010).
  28. Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  29. Morris, G., Jiruska, P., Jefferys, J. G. R., Powell, A. D. A New Approach of Modified Submerged Patch Clamp Recording Reveals Interneuronal Dynamics during Epileptiform Oscillations. Frontiers in Neuroscience. 10, 519 (2016).
  30. Valeeva, G., Valiullina, F., Khazipov, R. Excitatory actions of GABA in the intact neonatal rodent hippocampus in vitro. Frontiers in Cellular Neuroscience. , (2013).

Tags

Human HippocampusElectrophysiological RecordingsAcute Brain SlicesAnti-epileptic Drug DevelopmentTemporal Lobe EpilepsyCholine ACSFCarbogenationInterface ChamberVibratome

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Kraus, L., Monni, L., Schneider, U. C., Onken, J., Spindler, P., Holtkamp, M., Fidzinski, P. Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings. J. Vis. Exp. (159), e61085, doi:10.3791/61085 (2020).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image