提出的方案描述了被切除的人类海马组织的运输和制备,最终目标是使用重要的脑片作为潜在抗癫痫物质的临床前评估工具。
癫痫影响大约1%的世界人口,并导致生活质量的严重下降,由于持续的癫痫发作以及高风险的突然死亡。尽管有丰富的治疗方案,但约30%的患者具有耐药性。一些新的治疗方法已经开发使用动物模型,虽然耐药患者的速度保持不变。其中一个可能的原因是啮齿动物模型和人类之间缺乏翻译,例如动物模型中人类药理表现力的弱。被切除的人类脑组织作为临床前评估工具具有弥补这种转化差距的优势。这里描述的方法是人类海马脑切片的高质量制备,随后稳定地诱导表皮活动。该协议描述了在8mM KCl和4-氨基pyridin的应用过程中爆发活性的诱导。此活性对已建立的 AED 乳酰胺或新型抗癫痫候选物(如二甲苯二甲胺 (DMEA))敏感。此外,该方法还描述了通过减少细胞外Mg2+ 和应用双库线(GABAA 受体阻滞剂)来诱导人类海马脑切片CA1中癫痫发作样事件。实验装置可用于筛选潜在的抗癫痫物质,以发现其对表皮活性的影响。此外,在人体组织中,使用这种方法(例如,使用贴片夹记录)验证特定化合物的假设作用机制。最后,对重要的人脑组织外活体(这里,从患有叶癫痫的患者的修复海马)的研究将改善目前对人脑生理和病理机制的知识。
癫痫是最常见的神经系统疾病之一,影响世界人口的1%,并且与发病率和死亡率增加有关,。不幸的是,三分之一的癫痫患者是耐药性,尽管有大量的可用治疗方案,包括超过20个批准的抗癫痫药物(AED)3。未能将临床前动物研究的结果转化为临床试验,是许多患者前景看好的治疗策略无效的一个原因。最近,神经肽Y(NPY)和加拉宁在动物模型中被证明具有抗癫痫作用;然而,当在被修复的人类脑组织中测试时,只有NPY是有效的5。
关于基本神经机制和疾病治疗方法的现有知识大部分来自动物模型和细胞培养实验。虽然信息丰富,但这些模型只代表复杂的人类疾病和成人人类大脑网络的单一方面。或者,人脑组织有可能弥合转化间隙,但很少可用于功能研究。例如,死后脑组织一直是研究蛋白质表达、脑形态或解剖联系的宝贵工具,尽管神经元活动,经常受到损害,就是这种,组织66、7、8、9、10、11。9,10,11,78
相比之下,对活的人类脑组织进行了临床前药物评估、基本神经元功能和基因表达模式12、13、14、15、16、17,13,14,15,16,等研究。与啮齿类切片相比,人脑切片的一大优势是神经组织在切除和制备后具有长期生存能力。与啮齿动物大脑切片相比,人类大脑切片在制备后通常可记录长达8小时,其神经元切片显示稳定的神经元活性长达72小时,能够彻底调查这些稀有和有价值的样本12,18。12,
一些研究调查了表皮动物活性在切除皮质和海马人体组织不同区域的特性,并使用不同的方法诱导表皮表活性。在啮齿类切片中,表皮活性可以通过几种方法诱导:DG高耳细胞的电刺激,细胞外K+(8~12 mM KCl)的增加,双细胞素(BIC)阻断GABAAA受体,用4-氨基基氨酸(4-AP)阻断钾通道,去除或减少细胞外A溶液中的Mg+ 2+。然而,诱导表皮在人体组织中的活动需要至少两种方法的组合20,21,22。,21,22
这里介绍的是一种用于制备人类海马脑切片的方法,该切片可存活长达20小时,在应用高K+(8 mM)和4-AP或低Mg2+ 和BIC时显示表皮活性的诱导。
活的人类脑组织是进行前临床评估的一种非常有价值的工具,因为它恰当地代表了一个完好无损的人类大脑微网络。所提出的协议描述了一种组织运输和制备方法,该方法确保了高质量的海马切片,以及一种对进行 AED 评估至关重要的表皮活性的稳定诱导方法。
研究表皮表的活动,以及化学或电诱导的方法在人脑切片之前已经显示其他组17,20,21,22。,21,2217,该协议描述了通过应用高K+++4-AP,在不同患者的切片中诱导+稳定的突发活性,以及通过低Mg 2++BIC在CA1区域诱导S一次S经:研究发现,与诱导S经测试切片(一个患者中50%的经测试切片)更一致(15例患者中80%的试验切片)。然而,到目前为止,S下环的诱导只在一名患者中进行了测试。然而,建议采用低 Mg2++BIC 诱导 SES,因为 S下尚未能够使用高 K++4-AP 诱导。
一些研究引入了人类脑组织的运输和制备方法,并经常强调对神经元生存至关重要的三个因素:运输时间、使用的运输解决方案和储存条件。
为了获得最佳的切片生存能力,一些小组建议,被切除的脑组织的传输尽可能短。但是,操作室和实验室很少靠近,这意味着切片质量可能会因运输时间长而受到影响。一些组克服了这一障碍,在传输12期间对溶液应用常数 O 2。我们已经运输脑组织短(最大 = 15分钟)和长(长达1小时)的时间没有恒定的额外O 2供应在运输过程中,类似于其他组18,25。,25在这些情况下,在表皮记录期间未观察到组织质量的差异。在与其他研究所的交流中,切片质量也没有改变,因为贴片钳实验也没有变化。相比之下,组织质量的差异可能源于手术期间的损伤、长时间的切除和切片过程。
关于运输和切割溶液,所有已发布的方法都从溶液中省略了 NaCl,以减少由于渗透压力导致的细胞肿胀,类似于啮齿动物贴片夹实验的标准程序。然而,到目前为止,已经引进了几种替代品(即,基于蔗糖的ACSF13、22、,22基于NMDG的ACSF12、26,26和基于胆碱的ACSF 27)。Ting 和他的同事在 2014 年26年介绍了基于 NMDG 的 aCSF 切片准备,随后添加了恢复协议,该协议缓慢地将 NaCl 重新引入切片 28。然而,正如Ting等人所描述的,在基于NMDG的ACSF中培养的脑组织神经元表现出较高的膜电阻,从而在贴片夹实验26期间影响全细胞密封。因此,我们已经从基于NMDG的ACSF过渡到使用基于胆碱的ACSF 20,它为现场电位和补丁夹记录产生高质量的切片。
关于切片的储存,人们普遍认为接口条件为长片生存提供了最佳的氧合。然而,其他组显示切片生存长达72小时在水下条件下12。与之前的假设相反,与啮齿动物切片相比,人类脑片似乎对低氧合或氧化应激的抵抗力更强。接口室以前主要用于储存人类海马切片,但建议在贴片实验中为维持人脑切片而采用水下条件。
正如其他组所讨论的,长片生存的另一个关键步骤(接口为<48 h18,淹没为<72 h12)是防止细菌污染。啮齿动物脑片通常用于长达 8 小时的物理物理记录,细菌污染不被认为会影响切片在此期间的生存能力。从一次切除中准备的切片数量之多,以及人类脑组织异常可用,都凸显了延长人类脑切片生存能力的需要。该方法成功地描述了活人海马脑切片的准备,它很容易适应无菌条件。但是,对于此处执行的录制,切片生存期延长 20 h 不是优先事项。
在接口室中记录也被证明对诱导表皮活动(如SLE22)至关重要。由于低氧合,被淹没的条件很少用于记录 SES;然而,它们是贴片夹实验所需的光学高分辨率所必需的。由于高氧合和快速药物应用,使用优化的水下型记录室可以记录人脑切片中的表皮活性(细胞外场或单神经元)。在这里,介绍了现场潜在记录的方法和结果,但应该强调的是,使用这个修改的录音室在小鼠和人脑切片中成功地执行了贴片夹记录(未显示数据)。
与啮齿动物模型相比,被切除的人类脑组织具有较高的转化价值。它代表一个成人,患病的神经元网络,不能由icPC复制。然而,在任何体 外系统中, 人脑切片并不代表完整的人脑。此外,被切除的脑组织记录的神经元网络在手术或制备过程中由于损伤而可能发生大量的分子和功能变化。切片程序已被证明影响GABAergic功能,并可能影响表皮活性30的诱导。在制定假设时应考虑这些限制。在测试潜在的抗癫痫药物时,应考虑使用不同的大脑区域,因为药物靶点可能并非在所有人脑区域或所有患者中表达。特别是,TLE患者的海马经常表现出海马硬化症的迹象,并伴有严重的神经元细胞丧失。建议获取患者有关病理变化和疾病史的信息,如药物的潜在耐火材料,并在数据解释过程中考虑这一点。
总之,该方法成功地描述了活人海马脑切片的准备和诱导技术,用于记录两种不同类型的表皮活动。由于活的人类脑组织的供应是罕见的,应使用优化的传输和记录条件,以确保使用人脑切片的实验的最大输出。建议除啮齿动物模型和细胞培养实验外,可用作临床前验证工具。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢曼迪·马布勒-普埃特(柏林的慈善-无名小子)的出色技术援助。P.F. 由德国研究基金会 (DFG, 德国 Forschungsgemeinschaft) 根据德国的卓越战略 – EXC-2049-390688087 资助。这项工作得到了柏林卫生研究院QUEST生物医学研究中心的支持。
(+)-Na L-ascorbate | Sigma Aldrich | A4034 | |
4-AP | Sigma Aldrich | 275875-5G | |
Blades | eliteSERVE GmbH | HW3 | used for the vibratome |
CaCl2 | Merck | 102382 | |
Choline Cl | Sigma Aldrich | C1879 | |
Filter paper | Tiffen | EK1546027T | |
Gas-tight bottle caps | Carl Roth GmbH+Co.KG | E694.1 | |
Glass filaments | Science Products | GB150F-8P | for recording electrodes |
Glass gas disperser | DWK Life Sciences GmbH | 258573309 | |
Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
Interface Chamber | inhouse made | – | see Haas et al., 1979 |
KCl | AppliChem | 131494.1210 | |
Membrane (Cell culture inserts) | Merck | PICM030050 | |
Membrane chamber | inhouse made | – | see Hill and Greenfield, 2011 |
MgCl2∙6H2O | Carl Roth | HNO3.2 | |
MgSO4 | Sigma Aldrich | M7506 | |
Na pyruvate | Sigma Aldrich | P8574 | |
NaCl | Carl Roth | 3957.1 | |
NaH2PO4 | Merck | 106346 | |
NaHCO3 | Carl Roth | HNO1.2 | |
Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
Slice holder | Warner instruments | SHD-41/15 | |
Vertical puller | Narishige | PC-10 | |
Vibratome | Leica | VT1200S |