Summary

Un ensayo basado en electroquimioluminiscencia para variantes de proteínames MeCP2

Published: May 22, 2020
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Summary

El inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) es un enfoque novedoso para la detección cuantitativa de variantes de proteína MeCP2 endógenas y aplicadas exógenamente, que produce mediciones reproducibles altamente cuantitativas, precisas y ibles con un error bajo de intra e interensayo en un amplio rango de trabajo. Aquí, se describe el protocolo para el MeCP2-ECLIA en un formato de 96 pozos.

Abstract

El ECLIA es un método versátil que es capaz de cuantificar cantidades de proteínaendógenas y recombinantes en un formato de 96 pozos. Para demostrar la eficiencia de ECLIA, este ensayo se utilizó para analizar los niveles intrínsecos de MeCP2 en el tejido cerebral del ratón y la aceptación de TAT-MeCP2 en fibroblastos dérmales humanos. El MeCP2-ECLIA produce mediciones altamente precisas y reproducibles con un error bajo de intra e interensayo. En resumen, desarrollamos un método cuantitativo para la evaluación de variantes de proteínaMeCP2 que se puede utilizar en pantallas de alto rendimiento.

Introduction

El inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) se basa en un proceso que utiliza etiquetas diseñadas para emitir luminiscencia cuando se estimula electroquímicamente. Es una técnica ampliamente aplicable para la detección cuantitativa de analitos biológicos en la industria básica y la investigación académica, la industria alimentaria, así como en el diagnóstico clínico1. Comúnmente, se utiliza una placa desechable de 96 pocillos con electrodos de tinta de carbono. Estos electrodos actúan como un portador de fase sólida para el inmunoensayo. Un anticuerpo secundario se conjuga con una etiqueta electroquimioluminiscente y cuando se aplica electricidad al sistema, se desencadena la emisión de luz de la etiqueta química. Un dispositivo acoplado a carga de ruido ultrabajo (CCD) registra la intensidad de la luz que es directamente proporcional al antígeno enlazado al anticuerpo de captura, lo que resulta en la cuantificación del analito objetivo de la muestra2. En comparación con el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), ECLIA se considera ventajoso, ya que ofrece una mayor sensibilidad y reproducibilidad, así como una mejor automatización y consistencia3.

Aquí analizamos los niveles de proteína de unión metil-CpG 2 (MeCP2) en muestras de origen humano y murino, así como diferentes variantes de la proteína recombinante utilizando el sistema ECLIA recién desarrollado. MecP2 es una proteína de unión a ácido nucleico ligada al X que se sabe que interactúa con secuencias de ADN metiladas. Esta proteína ha estado implicada en la regulación de la expresión génica4,5. Las mutaciones de pérdida de función en el gen que codifica esta proteína son los principales culpables que causan el síndrome de Rett (RTT), un trastorno grave del neurodesarrollo6. Otro trastorno relacionado con MeCP2, el síndrome de duplicación MECP2, también conduce a síntomas neurológicos que pueden superponerse con los de RTT7. En particular, las hembras se ven afectadas principalmente por la RTT, mientras que los machos se ven afectados en su mayoría por el síndrome de duplicación MECP2 6,7.

Estos trastornos se asocian con niveles insuficientes o excesivos de MeCP2 respectivamente en el sistema nervioso central (SNC). Por lo tanto, las opciones de tratamiento para la RTT que implican el aumento de los niveles de MeCP2 en el SNC tendrían que evitar los efectos perjudiciales asociados con el exceso de MeCP27. Debido a este hecho, una cuantificación altamente sensible y precisa de los niveles de proteína MeCP2, según lo proporcionado por el sistema ECLIA, es crucial para el avance de la RTT, así como la investigación del síndrome de duplicación MECP2. Las mediciones precisas de los niveles endógenos y exógenos de MeCP2 a partir de líneas celulares humanas y muestras de tejido de ratón, así como una proteína recombinante que consiste en isoforma B mecp2 humana (también conocida como isoforma e1), y un dominio mínimo de transducción N-terminal VIH-TAT (TAT-MeCP2) que tiene el potencial de cruzar la barrera hemorrágucciona-cerebro8,9 se presentan en este trabajo.

Protocol

La aprobación para la adquisición de biopsias de piel con fines de investigación se obtuvo del Comité de ética de investigación humana del Hospital de Niños en Westmead, Australia. El consentimiento para experimentos con animales se obtuvo del Ministerio Federal de Ciencia, Investigación y Economía de Austria, que se realizaron de acuerdo con las regulaciones locales de bienestar animal (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015). NOTA: El principio del sistema ECLIA se muestra en <strong class="xfi…

Representative Results

El principio del sistema ECLIA se describe en la Figura 1. Las curvas estándar para dos variantes de MeCP2 se muestran en la Figura 2. La cuantificación precisa fue posible en una amplia gama de concentraciones (1-1.800 ng/mL). En la Figura 3,se analizaron los niveles de meCP2 de lisados derivados del cerebro del ratón y los HDF. La expresión de MeCP2 en los licentos nucleares cerebrales de ratones heterocigotos, salvajes y noqu…

Discussion

Para medir los niveles endógenos de MeCP2, MeCP2 y TAT-MeCP2, se desarrolló una placa de 96 pocillos ECLIA. Se ha demostrado que la pérdida de la función proteica MeCP2 conduce al síndrome de RTT6,para lo cual el tratamiento se limita actualmente al manejo de síntomas y terapia física. Una vía de tratamiento prometedora es la llamada terapia de reemplazo de proteínas, donde los niveles de MeCP2 se pueden valorar hasta su concentración necesaria12,,<sup …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Estamos muy agradecidos a la Dra. Brigitte Sturm por su apoyo con el instrumento ECLIA.

Materials

1,4-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich D9779 Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad Laboratories Inc. 500-0006 Sample preperation
Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit Meso Scale Diagnostics R32AB-1 Antibody
Discovery workbench 4.0 Meso Scale Discovery Software
DMEM (1X) gibco by Life Technologies 41966-029 Sample preperation
Dulbecco’s PBS (sterile) Sigma-Aldrich D8537-500ML Sample preperation, Washing solution, Coating solution
EDTA Sigma-Aldrich EDS Extraction Buffer
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F9665 Sample preperation
Glycerol Sigma-Aldrich G2025 Extraction Buffer
Gold Read Buffer T (1x) with surfactant Meso Scale Diagnostics R92TG MeCP2 ECLIA protocol
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
KIMBLE Dounce tissue grinder set Sigma-Aldrich D8938 Sample preperation
Laboratory Shaker, rocking motion (low speed) GFL 3014 MeCP2 ECLIA protocol
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20) Sigma-Aldrich M2670 Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01) Abnova Corporation H00004204-P01 Cell treatment
Microseal B seal Bio-Rad Laboratories Inc. MSB1001 for plate sealing
Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin Sigma-Aldrich M6818-100UL; RRID:AB_262075 Antibody, Coating solution
MSD Blocker A Meso Scale Diagnostics R93BA-4 Blocker
MSD SECTOR Imager 2400 Meso Scale Diagnostics I30AA-0 MeCP2 ECLIA protocol
Multi-Array 96-well Plate Meso Scale Diagnostics L15XB-3/L11BX-3 MeCP2 ECLIA protocol
Penicillin-Streptomycin gibco by Life Technologies 15140122 Sample preperation
Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit Eurogentec S.A. custom-designed Antibody
Potassium chloride (KCl) Merck KGaA 1049361000 Hypotonic lysis reagent
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11) Sigma-Aldrich SAB1404063; RRID:AB_10737296 Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6) Sigma-Aldrich WH0004204M1; RRID:AB_1842411 Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168) Sigma-Aldrich M6818; RRID:AB_262075 Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8) Sigma-Aldrich M7443; RRID:AB_477235 Antibody
Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3) Cell Signaling Technology 3456S; RRID:AB_2143849 Antibody
Protease Inhibitor Cocktail (100X) Sigma-Aldrich 8340 Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 Eurogentec S.A. custom Antibody
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 Merck 07-013 Antibody
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S3014 Extraction Buffer
SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat) Meso Scale Diagnostics W0015528S Antibody
TAT-MeCP2 fusion protein in-house production Cell treatment
Trypsin EDTA 0.25% (1X) gibco by Life Technologies 25200-056 Cell treatment
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416 Washing solution

Referencias

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Citar este artículo
Steinkellner, H., Beribisky, A. V., Mausberg, P., Christodoulou, J., Scheiber-Mojdehkar, B., Huber, A., Sarne, V., Laccone, F. An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants. J. Vis. Exp. (159), e61054, doi:10.3791/61054 (2020).

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