Электрохимилуминесценция на основе анализ для MeCP2 Белковые варианты
Summary
Электрохимилюминесценционный иммуноанализ (ECLIA) является новым подходом к количественному выявлению эндогенных и экзогенно применяемых белков meCP2 вариантов, который производит высококоличественные, точные и воспроизводимые измерения с низкой внутри- и межанализу ошибки в широком рабочем диапазоне. Здесь описан протокол MeCP2-ECLIA в формате 96 скважин.
Abstract
ECLIA является универсальным методом, который способен количественно эндогенных и рекомбинантных белков в формате 96-наилучшим образом. Чтобы продемонстрировать эффективность ECLIA, этот анализ был использован для анализа внутренних уровней MeCP2 в ткани мозга мыши и поглощения TAT-MeCP2 в человеческих кожных фибробластов. MeCP2-ECLIA производит высокоточные и воспроизводимые измерения с низкой погрешностью внутри- и межанализа. Таким образом, мы разработали количественный метод для оценки вариантов белка MeCP2, которые могут быть использованы в высокопроизводительных экранах.
Introduction
Электрохимилюминесценция иммуноанализ (ECLIA) основана на процессе, который использует этикетки, предназначенные для испускания люминесценции, когда электрохимически стимулировали. Это широко применимый метод количественного обнаружения биологических аналитов в основных отраслях промышленности и научных исследованиях, пищевой промышленности, а также в клинической диагностике1. Обычно используется одноразовая 96-колодная пластина с углеродными чернилами. Эти электроды выступают в качестве твердой фазы носителя для иммуноанализ. Вторичное антитело спрягается с электрохимилюминесцентной этикеткой, и при применении электричества к системе срабатывает световое излучение химической этикетки. Ультра-низкий шум заряда связаны устройства (CCD) записывает интенсивность света, который прямо пропорциональна антигена связаны с захватом антитела в результате количественной оценки целевого анализ образца2. По сравнению с фермент-связанных иммуносорбент анализа (ELISA), ECLIA считается выгодным, поскольку он предлагает более высокую чувствительность и воспроизводимость, а также лучшую автоматизацию и консистенцию3.
Здесь мы проанализировали уровень связывающего белка метил-CpG 2 (MeCP2) в образцах происхождения человека и мурина, а также различные варианты рекомбинантного белка с использованием недавно разработанной системы ECLIA. MecP2 — это x-связанный нуклеиновой кислотно-связывающий белок, который, как известно, взаимодействует с метилированными последовательностями ДНК. Этот белок был вовлечен в регуляцию экспрессии генов4,,5. Потеря функции мутаций в гене, который кодирует этот белок являются основными виновниками вызывая синдром Ретт (RTT), тяжелое расстройство нервнойсистемы 6. Другой MeCP2 связанных расстройство, синдром дублирования MECP2, также приводит к неврологическим симптомам, которые могут перекрываться с RTT7. Примечательно, что женщины в основном страдают от RTT в то время как мужчины в основном страдают от синдрома дублирования MECP2 6,7.
Эти расстройства связаны с недостаточным или избыточным уровнем MeCP2 соответственно в центральной нервной системе (ЦНС). Таким образом, варианты лечения RTT, которые включают повышение уровня MeCP2 в ЦНС необходимо, чтобы избежать пагубных последствий, связанных с превышением MeCP27. В связи с этим, очень чувствительныи и точные количественной оценки уровня белка MeCP2, как это предусмотрено системой ECLIA, имеет решающее значение для развития RTT, а также MECP2 исследования синдрома дублирования. Точные измерения эндогенных и экзогенных уровней MeCP2 из клеточных линий человека и образцов тканей мыши, а также рекомбинантный белок, состоящий из изоформы человека MeCP2 (также известный как изоформный e1), и минимальный N-терминальный ВИЧ-TAT трансдукционный домен (TAT-MeCP2), который имеет потенциал, чтобы пересечь гематоген-барьер8,представлены в этой работе.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для измерения эндогенных уровней MeCP2, рекомбинантных MeCP2 и TAT-MeCP2 была разработана 96-колодная пластина ECLIA. Было показано, что потеря функции белка MeCP2 приводит к синдрому RTT6, для которого лечение в настоящее время ограничивается симптомам управления и физической терапии. Одн…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы очень благодарны доктору Брижит Штурм за ее поддержку инструментом ECLIA.
Materials
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad Laboratories Inc. | 500-0006 | Sample preperation |
| Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit | Meso Scale Diagnostics | R32AB-1 | Antibody |
| Discovery workbench 4.0 | Meso Scale Discovery | Software | |
| DMEM (1X) | gibco by Life Technologies | 41966-029 | Sample preperation |
| Dulbecco’s PBS (sterile) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Sample preperation, Washing solution, Coating solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | Extraction Buffer |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Sample preperation |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | Extraction Buffer |
| Gold Read Buffer T (1x) with surfactant | Meso Scale Diagnostics | R92TG | MeCP2 ECLIA protocol |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| KIMBLE Dounce tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D8938 | Sample preperation |
| Laboratory Shaker, rocking motion (low speed) | GFL | 3014 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20) | Sigma-Aldrich | M2670 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01) | Abnova Corporation | H00004204-P01 | Cell treatment |
| Microseal B seal | Bio-Rad Laboratories Inc. | MSB1001 | for plate sealing |
| Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin | Sigma-Aldrich | M6818-100UL; RRID:AB_262075 | Antibody, Coating solution |
| MSD Blocker A | Meso Scale Diagnostics | R93BA-4 | Blocker |
| MSD SECTOR Imager 2400 | Meso Scale Diagnostics | I30AA-0 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Multi-Array 96-well Plate | Meso Scale Diagnostics | L15XB-3/L11BX-3 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Penicillin-Streptomycin | gibco by Life Technologies | 15140122 | Sample preperation |
| Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit | Eurogentec S.A. | custom-designed | Antibody |
| Potassium chloride (KCl) | Merck KGaA | 1049361000 | Hypotonic lysis reagent |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11) | Sigma-Aldrich | SAB1404063; RRID:AB_10737296 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6) | Sigma-Aldrich | WH0004204M1; RRID:AB_1842411 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168) | Sigma-Aldrich | M6818; RRID:AB_262075 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8) | Sigma-Aldrich | M7443; RRID:AB_477235 | Antibody |
| Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3) | Cell Signaling Technology | 3456S; RRID:AB_2143849 | Antibody |
| Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Sigma-Aldrich | 8340 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Eurogentec S.A. | custom | Antibody |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Merck | 07-013 | Antibody |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | Extraction Buffer |
| SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat) | Meso Scale Diagnostics | W0015528S | Antibody |
| TAT-MeCP2 fusion protein | in-house production | Cell treatment | |
| Trypsin EDTA 0.25% (1X) | gibco by Life Technologies | 25200-056 | Cell treatment |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Washing solution |
Referencias
- Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K., Bard, A. J. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. , 359-383 (2004).
- Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads. Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).
- Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies. Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).
- Shah, R. R., Bird, A. P. MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome. Genome Medicine. 9 (1), 17 (2017).
- Chahrour, M., et al. MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription. Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).
- Lyst, M. J., Bird, A. Rett syndrome: a complex disorder with simple roots. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).
- Katz, D. M., et al. Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation. Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).
- Steinkellner, H., et al. An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants. Scientific Reports. 9 (1), 7929 (2019).
- Laccone, F. A. . Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. , (2007).
- Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).
- Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. REAP: A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
- Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors. Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Nagahara, H., et al. Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration. Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).
- Trazzi, S., et al. CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder. Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).
- Van Esch, H. MECP2 Duplication Syndrome. Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).
- Collins, A. L., et al. Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice. Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).
- Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).
