זרימת עבודה זו מתארת את ביצועי הזמן והעשרת העלויות היעילות של שינויים מרובים בחלבון שלאחר ההעברה (לפטין) בו זמנית עבור ניתוח פרוטמית גלובלי כמותי. הפרוטוקול מנצל את העשרה ברמת הפפטיד PTM עם נוגדנים מרובה מצוחים, ואחריו נתונים עצמאיים רכישה המסה ניתוח ספקטרומטר מאסה כדי לקבל תובנות ביולוגיות לתוך הוצלב PTM.
לימוד שינויים מרובים שלאחר ההעברה (לפטין) של חלבונים הוא צעד מכריע כדי להבין הצלבות PTM ולקבל תובנות הוליסטי יותר לתפקוד חלבון. למרות החשיבות של מחקרים העשרה מרובי PTM, מחקרים מעטים לחקור יותר PTM אחד בכל פעם, בשל חלקית על ההוצאות, זמן, וכמויות חלבון גדול נדרש לבצע ניתוח פרוטמית גלובלי מרובים של לפטין. “אחד הסיר” הקרבה המפורטת בפרוטוקול זה גוברת על המחסומים הללו על ידי המתיר זיהוי סימולטני וקוונפיקציה של פפטידים עם שאריות ליזין המכילים מרחרחון וסורחון בכמות נמוכה של דגימה קלט. הפרוטוקול כולל הכנת מחלת חלבון מתוך כבדי העכבר של SIRT5 הסתרה, הביצועים של טריפסין העיכול, העשרה לפטין, וביצועים של ניתוח ספקטרומטרי מסה באמצעות הרכישה עצמאית נתונים (DIA) זרימת עבודה. מאחר שזרימת עבודה זו מאפשרת העשרה של שתי מילישניות ממדגם זהה בו זמנית, היא מספקת כלי מעשי לחקר הוצלב PTM מבלי לדרוש כמויות גדולות של דגימות, וזה מפחית מאוד את הזמן הנדרש עבור הכנה לדוגמה, נתונים רכישה וניתוח. רכיב ה-DIA של זרימת העבודה מספק מידע מקיף הספציפי ל-PTM. זה חשוב במיוחד כאשר לימוד לוקליזציה של האתר PTM, כמו DIA מספק סטים של יוני קטעים שיכולים להיות מפוענח מבחינה חישובית כדי להבדיל בין לוקליזציה שונים PTM isoforms.
מספר עצום של שינויים שלאחר המעבר באופן דינאמי להסדיר חלבונים ומסלולים באמצעות אפקטים על הפעילות1, איתות2, ומחזור3,4. לדוגמה, מופעלות החלבונים מופעלים או מנוטרלים על-ידי הוספת קבוצות פוספט5, ומרחרחון ושינויים אחרים מספקים מנגנון לשינוי מבנה כרומטין ומשמשים כמנגנוני הרגולציה הטרנססוניים6,7. בשנים האחרונות, הראיות נטען כי עבודה מרובים לפטין בקונצרט או להתחרות כדי להסדיר את תפקוד החלבון או פעילות8,9,10,11. לכן, הבנת הצלבות PTM היא הצורך המתעוררים במחקר PTM. עם זאת, מרבית זרימות העבודה הזמינות לזיהוי ולכמת אתרי PTM להתמקד בשינויים בודדים, ולא הגומלין של שינויים מרובים. זרימת העבודה המתוארת מתאמת שינוי מסוים בחלבון “נקודות חמות” ושאריות ליזין שהשתנו על-ידי מספר מרובה של מיליפטין.
יש צורך הולך וגובר בקהילה המדעית בשביל שיטות שונות ללמוד במקביל בו12. רוב השיטות כדי לזהות ולכמת באופן כללי את האתרים של סוגים מרובים של לפטין הם מאתגרים בשל העלויות הגבוהות וכמות הרקמות הנדרשות12,13. לא רק הם ניסויים העשרה multi-PTM הזמן צורכת מבחינת ההכנה לדוגמה, רכישת נתונים, ניתוח נתונים, אבל מחקרים אלה דורשים בדרך כלל גדול ולעתים קרובות כמויות של חלבון11. המתואר כאן הוא פרוטוקול להעשרה וניתוח בו של מספר מיני מדינות, אשר גם מטפל בכמה מחסומים אלה ומאפשר יצירת פרופיל PTM בקנה מידה גדול והערכת הצלבות בין שונות לפטין14. זו זרימת העבודה של סיר אחד מתווה דרך מעשית עבור חוקרים ביורפואיים לפרופיל גלובלי מרובים לפטין, לזהות פפטידים שונו, וללמוד ptm הוצלב בדרך יעילה וחסכונית14,15.
כאן, שיטה זו היא לראווה על ידי בחינת אכלציה חלבון מיטוכונדריאלי, אשר נחקרו לראשונה לפני 50 שנים16. זה מתמקד במיוחד על ליזין מרחלציה17 ו סורחון18, כולל המופע המשותף של שינויים אלה על חלבונים ואפילו שיתוף השינוי ברמת פפטיד. מאז המחקר משתמש sirtuin 5 (SIRT5) הסתרה מודל העכבר, זה נבחר להתמקד על העשרה של מרחלציה ואתרי סורחון. החלטה זו נעשתה מכיוון שאתרי הסולציה הם מטרות של SIRT5 דסוינילאז, ולכן הם צפויים להראות upregulation משמעותיים בעכברים קו, מה שהופך אותם לחלק הרלוונטי ביותר במקרה זה. שתי מילישניות הן רלוונטיות ביולוגית כפי שמסוכם לאחרונה על ידי קאריקו ואח ‘19. באופן כללי, מרחלציה מראה השפעות חשובות על ביטוי גנים ומטבוליזם, וסורחון דווח לווסת את חילוף החומרים של הלב ותפקוד20.
הפרוטוקול המתואר ניתן לבצע עם כמות נמוכה של חומר קלט חלבון (g., 1 מ ג של חלבון ליפוסט) ומפחית את המשך הכולל של הניסוי על ידי הפחתת הזמן שהושקע עבור עיבוד דגימת, MS הרכישה, וניתוח נתונים. תרשים שרטוט של זרימת עבודה מסופק באיור 1. השתמשנו גם כמויות נמוכות יותר של חומר התחלתי (עד 100 μg של חלבון ליפוסט, להקטין את כמויות החרוזים בשימוש בהתאם), אשר כצפוי, מפחית את התשואה הכוללת של פפטידים acylated מזוהה; עם זאת, הוא עדיין מספק תוצאות בעלות ערך רב ופפטידים acylated הניתנות לכימות.
בעוד זרימות עבודה מלמעלה-למטה או הביניים למטה בדרך כלל לא להשתמש בגישות לעיכול פרוטחרדה (ובכך לשמור על הקישוריות של מספר לפטין בתוך חלבון אחד), פרוטוקול זה מתמקד בגישה מבוססת פפטיד העשרה כדי לצבור עומק נוסף רגישות עבור זיהוי PTM וכימות (איור 1). בנוסף, זו זרימת העבודה פפטיד-ממוקד מנצל שיטות מודרניות ספקטרומטר המסה, כולל 1) שילוב של רכישה תלוי נתונים (דה) כדי ליצור ספריות ספקטרליות, ו 2) לרכוש עצמאית נתונים (DIA) עבור כימות PTM מדויק בתהליך עבודה ללא תווית.
זרימות עבודה של DIA להתגבר על מערכת הדגימה של מערכות הסריקה האופייניות של דה-לוד באמצעות מקטעים מגוונים באופן מקיף את כל האותות הפפטיד בטווח של21שנדגמו. תכונה זו גם מועילה מאוד מבחינת הלוקליזציה של האתר, כי קל יותר לקבל מידע לגבי אילו יוני קטעים ספציפיים משתנים בתוך הפפטיד. בנוסף, זרימות עבודה של DIA מאפשרות זיהוי וכימות של מקטין PTM-פפטיד איזוטפסים עם יונים מקודמן זהה. שיטות DIA יכולות גם לקבוע לוקליזציה מסוימת של אתר PTM בתוך פפטיד המבוססת על יוני קטעים מתאימים ספציפיים הנמדדים בכל עת. עם זאת, גישה לעתים קרובות לנצל “הדרה דינמית” תכונות שאינן כוללות דגימה מרובים של MS/MS עבור אותו יון מקודמן, ובכך חסר PTM מינורי.
אסטרטגיית ההעשרה הזמנית המתוארת כאן מתאימה באופן אידיאלי למחקרים שיפיקו תועלת מפרופיל עולמי וככמת של מספר רב של מדים לפטין, בחינת מוצלב PTM, והבנת האינטראקציות הדינמיות של שינויים שלאחר ההעברה. זיהוי של מספר לפטין מועשר בזרימת עבודה אחת משולבת תוארה על ידי: גלובל, סדרתי או מקביל העשרה של PTM המכיל פפטידים בחרדה, או לחילופין על ידי ניתוח של חלבונים שלמים. בהשוואה ישירה עם העשרה סדרתיים של מרחלציה וסורחון, היעילות של מתודולוגיית הסיר החד הוקמה כדומה מאוד ל-14. פרוטוקולים חלופיים אלה דורשים כמויות משמעותיות של חומר התחלתי וזמן יכול להיות יקר באופן גמיש. לעומת זאת, פרוטוקול חד-סיר מספק שיטה זולה ויעילה להעשרה של יותר מ-PTM אחד עם הניתוח והזיהוי הבאים.
רקמות הכבד של העכבר מתקבלים מ SIRT5 הסתרה עכברים ומשמשים כאן כחומר מתחיל. פרוטוקול זה יכול גם להתבצע לקבל חלבון lysates מרקמות שונות או ניסויים בתרבות התא. פרוטוקול זה יכול להיות מוחל על lysates חלבונים המתקבלים מרקמות או כדורי תרבות התא.
פרוטוקול זה מתאר טכניקה מקורית של העשרה PTM בו מרובים כדי להבין בצורה יעילה יותר את הוצלב PTM. שיטות חלופיות להגיע למטרה זו נוטות להיות מצרך ארוך ויקר בזמן, והם דורשים כמויות גדולות של חלבון כדי להצליח11,13. פרוטוקול זה מציג את זרימת העבודה העשרה PTM המערבת הדגירה של הנוגדן חרוזים מצודים עבור שני לפטין בו כדי לשפר את היעילות הכוללת של הניסוי. שיטה זו כרוכה גם השימוש דה עבור הדור הספריה ספקטרלית ורכישות DIA MS כדי לזהות ולכמת את פפטידים נוכח הפרעה מופחתת מיוני קטע22,23. תוכנות, כגון מנועי החיפוש של MS מסד נתונים משמשים לניתוח ומכמת נתונים מרכישות לוד, בעוד תוכנת פרוטאומניקס כמותית24 ו ניתוח מסוים כמותי התוכנה25 יש צורך לפרש את ספקטרום מורכב המיוצר על ידי הרכישות דיה.
ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה שיש לעקוב אחריהם בזהירות. ככל שהמטרה העיקרית של הפרוטוקול היא להעשיר עבור מספר רב של מונים בו, השלב ההעשרה של הנוגדן (סעיף 2) הוא קריטי להצלחת הניסוי. בעת ביצוע שוטף על החרוזים, זה הכרחי כדי להבטיח שאף אחד החרוזים לא מנושב בטעות. הבטחת ריכוז אוריאה כבר מדולל ל 1 M לפני העיכול עם טריפסין (שלב 1.8) הוא גם הכרחי. למרות 8 M אוריאה נדרש קודם לכן בפרוטוקול עבור מסיסות חלבון, ריכוזי אוריאה מעל 1 M לעכב את פעילות אנזימטית של טריפסין. בנוסף, חשוב לבדוק בעקביות את ה-pH של המדגם לאורך כל הפרוטוקול. זה חשוב במיוחד לפני העיכול. אם ה-pH של המדגם ואת התמיסה טריפסין אינם מנוטרלים כראוי לפני הדגירה, זה יכול לגרום לעיכול לא יעיל שבו אתרי מחשוף רבים עלולים להיות מחמיץ, וכתוצאה מכך פחות שמות פפטיד.
כמה שינויים בפרוטוקול עשויים להועיל בעת הכנת דגימות. עבור חלבון ליפוסט מתוך 1 מ”ג של חומר התחלתי, רבע של חרוזי נוגדנים המסופקים בכל צינור סריקה PTM ניתן להשתמש כחלופה חסכונית. כמות גדולה יותר של חומר התחלתי ניתן להשתמש לתוצאות טובות יותר, כל עוד כמות של חרוזי נוגדן המשמשים מוגברת באופן פרופורציונלי. שינוי נוסף שיכול לשפר את זרימת העבודה הוא לעכל דגימות עם פרוטאז אחר בנוסף לטריפסין. שינוי זה יגרום להשתנות יותר הפפטידים ביקבו, מתן כיסוי מוגבר של שאריות חלבון. למרות שאין צורך בכך, מומלץ להשתמש בטריפסין כאחד מהאנזימים המשמשים לניתוח PTM בשל המחשוף הגבוהשלה.
הגבלה של פרוטוקול זה היא כי לומדים לחקור את הצורך בchemistries דומים כדי להיות מועשר בו זמנית14. ההליכים עבור מחרוזת נוגדנים שונים החרוזים חייב להיות דומה, ניצול ממיסים ופתרונות דומים, כולל תנאי הימנעות דומים, ורצוי מאותו ספק. מסיבה זו, השיטה המתוארים כאן משתמשת באופן עקבי באצטלציה ובסורחון כדוגמה, שניהם משתמשים בכלי השימוש בנוגדנים בחרוזים (תא איתות טכנולוגיה, Inc). למרות ששיטה זו יכולה תיאורטית להיות מוחלת על כל מספר של פטין, מחקרים נוספים יהיו נחוצים כדי להעריך את המגבלה המדויקת של הפרוטוקול בהקשר זה. יתרה מזו, מאחר שזוהי שיטת העשרה המבוססת על נוגדן, השיטה יכולה לספק רק קוונפיקציה יחסית של אתרי PTM.
בהשוואה לשיטות העשרה הקיימות של מולטי-PTM, זרימת עבודה זו היא חלופה אפשרית וחסכונית יותר. מתוך ניסוי זה, נצפתה כי היעילות של שיטה זו משווה בצורה מאוד טובה עם שיטות חלופיות, כגון enrichments בודדות או טוריות. איור 2B מראה כי קורות חיים חציון עבור שונה אזורי השיא פפטיד הצטמצמה למעשה בשיטה אחת-סיר בהשוואה ל יחיד ptm enrichments ו-serial-ptm enrichments13. ניתחנו עוד את התוצאות הנסיוניות הערכת כימות ברמת האתר לאצטלציה או לסורחון. בנוסף, ניתוח מתאם ספיטמן (איור 2ג, ד) הראה כי העשרת הסיר ptm האחד הופיע באופן דומה לזרימות העבודה העשרה בודדות. הדבר נכון גם לגבי יחסי המין הפפטיד-וברמת הרסיס. אותה התבוננות שנערכה עבור כל שלושת הקשרים בעת השוואת סיר אחד עם העשרה טורית PTM.
פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים להפוך תובנות ביולוגיות מרתקות לתוך הוצלב PTM באופן מהיר וחסכוני. רכיב ה-DIA של זרימת העבודה מאפשר לחוקרים להבין יותר אודות האזור, כפי שהוא מספק מידע על הלוקליזציה של האתר ומתגבר על אתגרים כגון תפוסת האתר הנמוכה של לפטין. יוני מקודמן נוטים להיות כלולים עם דה, אשר חשוב במיוחד כאשר לימוד האתר הפרטי, כאשר תפוסת אתרים היא לעתים ניתן לבצע ניסויים מעקב כדי להעריך את הגבול העליון של כמה מילישניות ניתן להעשיר בו זמנית באמצעות שיטה זו. שיפור עתידי של זרימת עבודה זו עשוי לכלול פיתוח של פלטפורמות תוכנה מתקדמות יותר כדי להפוך עוד יותר את הניתוח של לוקליזציה באתר ותפוסת האתר PTM.
The authors have nothing to disclose.
אנו מכירים בתמיכה מתוך מענק מכשור משותף NIH עבור מערכת הטריפלתוף במכון באק (1S10 OD016281). עבודה זו הייתה נתמכת גם על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (R01 AI108255 to בולשיט) והמכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות (R24 DK085610 לאריק Verdin; R01 DK090242 לאריק גועצממן). X.X. היה נתמך על ידי מענק של המכון הלאומי לבריאות (NIH גרנט T32GM8806, לג Campisi ו ליסה Ellerby), N.B. היה נתמך על ידי מלגת דוקטורט מקרן גלן למחקר רפואי.
1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408 | |
Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 36XL66 | |
Bioruptor sonicator | Diagenode, Denville, NJ, USA | B01020001 | |
C18 pre-column chip (200 µm x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 5015841 | |
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 804-00001 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
Eppendorf Thermomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock) | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 22363352 | |
Formic acid | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507-500ML | |
Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
mapDIA | web link | software for interference removal of DIA datasets | |
Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC230-4 | |
PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser | VWR International, Radnor, PA, USA | 89204-088 | |
mProphet in Skyline | incorporated in Skyline | integrated statistical algorithms for FDR assessments | |
Oasis HLB SPE cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT094225 | cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material |
Phosphate buffered saline solution | Life Technologies | 10010023 | |
Pierce BCA Assay | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 23225 | |
ProteinPilot 5.0 – 'MS database search engine' | SCIEX, Framingham, MA, USA | software download SCIEX | MS database search engine |
PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764 | Cell Signaling Technology | 13764 | antibody beads for affinity enrichment |
PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416 | Cell Signaling Technology | 13416 | antibody beads for affinity enrichment |
Sequencing-grade lyophilized trypsin | Life Technologies | 23225 | |
Skyline – 'Quantitative Proteomics Software' | MacCoss lab (academic) | open source software | Quantitative Proteomics Software (academic) |
Spectronaut – 'DIA Quantitative Analysis Software' | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization |
Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | instrument to concentrate liquid volume of samples |
TissueLyser II | Qiagen, Hilden, Germany | 85300 | instrument for efficient lysis of tissue |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508-1L | |
TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer | SCIEX, Framingham, MA, USA | Per quote | high resolution mass spectrometer |
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | Model #845 | chromatographic separation system |
Urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
Water, Burdick and Jackson LC-MS | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 600-30-76 | |
ZipTip C18 Pipette Tips, P10 | Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL | ZTC18S096 | C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures |