Dieser Workflow beschreibt die Gleichzeitige der zeit- und kosteneffizienten Anreicherung mehrerer Protein-Post-Translational-Modifikationen (PTMs) für die quantitative globale proteomische Analyse. Das Protokoll nutzt ptM-Anreicherung auf Peptidebene mit mehreren konjugierten Antikörpern, gefolgt von einer datenunabhängigen Erfassungsmassenspektrometrieanalyse, um biologische Einblicke in PTM-Übersprechen zu gewinnen.
Das Studium mehrerer posttranslationaler Modifikationen (PTMs) von Proteinen ist ein entscheidender Schritt, um PTM-Übersprachung zu verstehen und ganzheitlichere Einblicke in die Proteinfunktion zu gewinnen. Trotz der Bedeutung von Multi-PTM-Anreicherungsstudien untersuchen nur wenige Studien mehr als ein PTM gleichzeitig, was teilweise auf die Kosten, die Zeit und die großen Proteinmengen zurückzuführen ist, die für die Durchführung mehrerer globaler proteomischer Analysen von PTM erforderlich sind. Die in diesem Protokoll beschriebene “Ein-Topf”-Affinitätsanreicherung überwindet diese Barrieren, indem sie die gleichzeitige Identifizierung und Quantifizierung von Peptiden mit Lysinrückständen ermöglicht, die Acetylierungs- und Präsinylierungs-PTM mit geringen Probenmengen enthalten. Eingabe. Das Protokoll umfasst die Herstellung von Proteinlysat aus Mauslebern von SIRT5-Knockout-Mäusen, die Leistung der Trypsin-Verdauung, die Anreicherung für PTMs und die Durchführung von Massenspektrometrie-Analysen mit einem datenunabhängigen Erfassungsworkflow (DIA). Da dieser Workflow die gleichzeitige Anreicherung von zwei PTMs aus derselben Probe ermöglicht, bietet er ein praktisches Werkzeug, um PTM-Übersprechen zu untersuchen, ohne dass große Probenmengen erforderlich sind, und reduziert den Zeitaufwand für die Probenvorbereitung und -daten erheblich. Akquisition und Analyse. Die DIA-Komponente des Workflows bietet umfassende PTM-spezifische Informationen. Dies ist besonders wichtig, wenn die PTM-Standortlokalisierung untersucht wird, da DIA umfassende Sätze von Fragmentionen bereitstellt, die rechnerisch entschlüsselt werden können, um zwischen verschiedenen PTM-Lokalisierungsisoformen zu unterscheiden.
Eine Vielzahl von post-translationalen Modifikationen regulieren dynamisch Proteine und Bahnen durch Effekte auf die Aktivität1, Signalisierung2und Umsatz3,4. Zum Beispiel werden Proteinkiinasen durch Zugabe von Phosphatgruppen5aktiviert oder deaktiviert, und Histonacetylierung und andere Modifikationen bieten einen Mechanismus, um die Chromatinstruktur zu ändern und als transkriptionelle Regulierungsmechanismen6,7zu dienen. In den letzten Jahren hat sich der Beweis, dass mehrere PTMs arbeiten in Konzert oder konkurrieren, um Proteinfunktion oder Aktivität zu regulieren8,9,10,11. Daher ist das Verständnis von PTM-Crosstalk ein aufkommender Bedarf in der PTM-Forschung. Die meisten verfügbaren proteomischen Workflows zum Identifizieren und Quantifizieren von PTM-Sites konzentrieren sich jedoch auf einzelne Modifikationen und nicht auf das Zusammenspiel mehrerer Änderungen. Der beschriebene Workflow korreliert spezifische Proteinmodifikationen “Hot-Spots” und Lysinrückstände, die durch mehrere verschiedene PTMs modifiziert werden.
In der wissenschaftlichen Gemeinschaft wächst der Bedarf an praktikablen Methoden, um mehrere PTMs gleichzeitig zu untersuchen12. Die meisten Methoden zur globalen Identifizierung und Quantifizierung der Standorte mehrerer Arten von PTMs sind aufgrund der hohen Kosten und der menge des erforderlichen Gewebes eine Herausforderung12,13. Multi-PTM-Anreicherungsexperimente sind nicht nur zeitaufwändig in Bezug auf Probenvorbereitung, Datenerfassung und Datenanalyse, sondern diese Studien erfordern in der Regel große und oft unerschwingliche Mengen an Protein11. Hier wird ein Protokoll zur gleichzeitigen Anreicherung und Analyse mehrerer PTMs beschrieben, das auch mehrere dieser Barrieren anspricht und eine groß angelegte PTM-Profilerstellung und Diebewertung von Crosstalk zwischen verschiedenen PTMs14ermöglicht. Dieser Ein-Topf-Workflow skizziert eine praktische Möglichkeit für biomedizinische Forscher, mehrere PTMs global zu profilieren, co-modifizierte Peptide zu identifizieren und PTM-Übersprechen auf effiziente und kostengünstige Weise zu untersuchen14,15.
Hier wird diese Methode durch die Untersuchung der mitochondrialen Proteinacylierung gezeigt, die erstmals vor über 50 Jahren untersucht wurde16. Es konzentriert sich speziell auf Lysin-Acetylierung17 und Präsinylierung18, einschließlich des Ko-Vorkommens dieser Modifikationen an Proteinen und sogar Co-Modifikation auf Peptidebene. Da die Studie ein Sirtuin 5 (SIRT5) Knockout-Maus-Modell verwendet, wurde es ausgewählt, sich auf die Anreicherung von Acetylierungs- und Bernstein-Sites zu konzentrieren. Diese Entscheidung wurde getroffen, weil Prägnsalverfahren Ziele von SIRT5 Desuccinylase sind und daher erwartet werden, dass sie bei KO-Mäusen eine signifikante Upregulation aufweisen, was sie in diesem Fall zu den relevantesten PTMs macht. Beide PTMs sind biologisch relevant, wie kürzlich von Carrico et al.19zusammengefasst. Im Allgemeinen zeigt acetylierung wichtige Auswirkungen auf die Genexpression und den Stoffwechsel, und Succinylierung wurde berichtet, um den Herzstoffwechsel und Die Funktion zu regulieren20.
Das beschriebene Protokoll kann mit einer geringen Menge an Protein-Eingangsmaterial (z. B. 1 mg Proteinlysat) durchgeführt werden und reduziert die Gesamtdauer des Experiments, indem die Fürlange für die Probenverarbeitung, MS-Erfassung und Datenanalyse reduziert wird. Ein Workflowschema ist in Abbildung 1angegeben. Wir haben auch noch geringere Mengen an Ausgangsmaterial verwendet (bis zu 100 g Proteinlysat, das die entsprechend verwendeten Perlenmengen reduziert), was erwartungsgemäß die Gesamtausbeute der identifizierten azylaten Peptide reduziert; Es liefert jedoch immer noch sehr wertvolle Ergebnisse und quantifizierbare acylated Peptide.
Während so genannte Top-Down- oder Middle-Down-Workflows in der Regel keine proteolytischen Verdauungsansätze verwenden (und somit die Konnektivität mehrerer PTMs innerhalb eines Proteins beibehalten), konzentriert sich dieses Protokoll auf einen Peptid-basierten Affinitätsanreicherungsansatz, um zusätzliche Tiefe und Empfindlichkeit für die PTM-Identifikation und -Quantifizierung zu erhalten (Abbildung 1). Darüber hinaus nutzt dieser peptidzentrierte Workflow moderne Massenspektrometriemethoden, einschließlich 1) einer Kombination aus datenabhängiger Erfassung (DDA) zur Erzeugung von Spektralbibliotheken und 2) datenunabhängiger Erfassung (DIA) für eine genaue PTM-Quantifizierung in einem etikettenfreien Workflow.
DIA-Workflows überwinden die Sampling-Stochasticity typischer DDA-Scanschemata, indem alle Peptidsignale innerhalb des abgetasteten m/z-Bereichs21umfassend fragmentiert werden. Diese Funktion ist auch äußerst vorteilhaft in Bezug auf die Lokalisierung der Site, weil es einfacher ist, Informationen darüber zu erhalten, welche spezifischen Fragmentionen innerhalb des Peptids modifiziert werden. Darüber hinaus ermöglichen DIA-Workflows die Identifizierung und Quantifizierung kleinerptamischer Peptid-Isoformen mit identischen Vorläuferionen. DIA-Methoden können auch eine spezifische PTM-Standortlokalisierung innerhalb eines Peptids auf der Grundlage spezifischer entsprechender Fragmentionen bestimmen, die jederzeit umfassend gemessen werden. DDA-Ansätze verwenden jedoch häufig “dynamische Ausschluss”-Funktionen, die eine mehrfache Probenahme von MS/MS für dasselbe Vorläuferion ausschließen, wodurch kleinere PTM-Isoformen fehlen.
Die hier beschriebene Strategie zur gleichzeitigen Anreicherung eignet sich ideal für Studien, die von der globalen Profilierung und Quantifizierung mehrerer PTMs, der Untersuchung von PTM-Crosstalk und dem Verständnis der dynamischen Wechselwirkungen posttranslationaler Modifikationen profitieren. Die Identifizierung mehrerer angereicherter PTMs in einem kombinierten Workflow wurde beschrieben durch: globale, serielle oder parallele Anreicherung von PTM, das proteolytische Peptide enthält, oder alternativ durch die Analyse intakter Proteine. Im direkten Vergleich mit der seriellen Anreicherung von Acetylierung und Präsination wurde die Effizienz der Ein-Topf-Methodik als sehr ähnlich14festgelegt. Diese alternativen Protokolle erfordern erhebliche Mengen an Ausgangsmaterial und Zeit und können unerschwinglich teuer sein. Im Gegensatz dazu bietet das One-Pot-Protokoll eine kostengünstige und effiziente Methode zur Anreicherung von mehr als einem PTM mit anschließender Analyse und Identifikation.
Mauslebergewebe werden von SIRT5 Knockout-Mäusen gewonnen und hier als Ausgangsmaterial verwendet. Dieses Protokoll kann auch für Proteinlysate aus verschiedenen Geweben oder Zellkulturexperimenten durchgeführt werden. Dieses Protokoll kann auf Proteinlysate angewendet werden, die aus Geweben oder Zellkulturpellets gewonnen werden.
Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Technik zur gleichzeitigen mehrfachen PTM-Anreicherung, um PTM-Übersprechen effektiver zu verstehen. Alternative Methoden zur Erreichung dieses Ziels sind in der Regel unerschwinglich zeitaufwändig und teuer, und sie erfordern große Mengen an Protein, um erfolgreich zu sein11,13. Dieses Protokoll stellt einen Multi-PTM-Anreicherungsworkflow dar, der die Inkubation in antikörperkonjugierten Perlen für zwei PTMs gleichzeitig beinhaltet, um die Gesamteffizienz des Experiments zu verbessern. Diese Methode beinhaltet auch die Verwendung von DDA für die Erzeugung von Spektralbibliotheken und DIA MS-Erfassungen, um die Peptide zu erkennen und zu quantifizieren, die mit reduzierten Interferenzen von Fragmentionen22,23vorhanden sind. Softwareprogramme, wie z. B. MS-Datenbanksuchmaschinen, werden verwendet, um Daten aus DDA-Akquisitionen zu analysieren und zu quantifizieren, während quantitative Proteomics Software24 und spezifische DIA Quantitative Analysis Software25 notwendig sind, um die komplexen Spektren zu interpretieren, die durch DIA-Akquisitionen erzeugt werden.
Es gibt mehrere wichtige Schritte innerhalb dieses Protokolls, die sorgfältig befolgt werden sollten. Da das Hauptziel des Protokolls darin besteht, mehrere PTMs gleichzeitig anzureichern, ist der Anti-Antikörper-Affinitätsanreicherungsschritt (Abschnitt 2) entscheidend für den Erfolg des Experiments. Bei der Durchführung von Wärteilen an den Perlen ist es notwendig, sicherzustellen, dass keine der Perlen versehentlich angesaugt wird. Es ist auch notwendig, dass die Harnstoffkonzentration vor der Verdauung mit Trypsin (Schritt 1.8) auf 1 M verdünnt wurde. Obwohl 8 M Harnstoff früher im Protokoll zur Proteinlöslichkeit benötigt wird, hemmen Harnstoffkonzentrationen über 1 M die enzymatische Aktivität von Trypsin. Darüber hinaus ist es wichtig, den pH-Wert der Probe im gesamten Protokoll konsequent zu überprüfen. Dies ist besonders wichtig vor der Verdauung. Wenn der pH-Wert der Probe und die Trypsin-Lösung vor der Inkubation nicht angemessen neutralisiert werden, kann dies zu einer ineffizienten Verdauung führen, bei der viele Dekolleté-Stellen übersehen werden können, was zu weniger Peptid-Identifikationen führen kann.
Einige Änderungen am Protokoll können beim Vorbereiten von Beispielen hilfreich sein. Für ein Proteinlysat, das aus 1 mg Ausgangsmaterial beschafft wird, kann ein Viertel der in jedem PTM-Scanrohr enthaltenen Antikörperperlen als kostengünstige Alternative verwendet werden. Eine größere Menge an Ausgangsmaterial kann für bessere Ergebnisse verwendet werden, solange die Menge der verwendeten Antikörperperlen proportional erhöht wird. Eine weitere Änderung, die den Workflow verbessern kann, ist, Proben mit einer anderen Protease zusätzlich zu Trypsin zu verdauen. Diese Änderung würde zu einer größeren Variabilität der geklammerten Peptide führen und eine erhöhte Abdeckung von Proteinrückständen bieten. Obwohl nicht notwendig, wird empfohlen, dass Trypsin eines der Enzyme für die PTM-Analyse aufgrund seiner hohen Spaltungssspezifität26sein sollte.
Eine Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass die untersuchten PTMs ähnliche Chemikalien benötigen, um gleichzeitig angereichert zu werden14. Die Verfahren für die verschiedenen Antikörperkonjugatierten Perlen müssen ähnlich sein und ähnliche Lösungsmittel und Lösungen, einschließlich ähnlicher Elutionsbedingungen, und vorzugsweise vom gleichen Anbieter verwenden. Aus diesem Grund verwendet die hier skizzierte Methode konsequent Acetylierung und Prägnantierung als Beispiel, die beide antikörperkonjugierte Perlen verwenden (Cell Signaling Technology, Inc). Obwohl diese Methode theoretisch auf eine beliebige Anzahl von PTM angewendet werden kann, wären zusätzliche Studien erforderlich, um die genaue Einschränkung des Protokolls in dieser Hinsicht zu bewerten. Da es sich um eine Antikörper-basierte Anreicherungsmethode handelt, kann die Methode nur eine relative Quantifizierung von PTM-Standorten ermöglichen.
Im Vergleich zu bestehenden Multi-PTM-Anreicherungsmethoden ist dieser Workflow eine praktikablere und kostengünstigere Alternative. Aus diesem Experiment wurde festgestellt, dass die Wirksamkeit dieser Methode sehr gut mit alternativen Methoden wie individuellen oder seriellen Anreicherungen verglichen wird. Abbildung 2B zeigt, dass der mediane CV für modifizierte Peptidspitzenbereiche im Ein-Topf-Verfahren im Vergleich zu Ein-PTM-Anreicherungen und seriellen PTM-Anreicherungen13tatsächlich verringert wurde. Wir analysierten weiter die experimentellen Ergebnisse, die Quantifizierungen auf Standortebene für Acetylierung oder Präsination bewerten. Darüber hinaus zeigte die Spearman-Korrelationsanalyse (Abbildung 2C,D) , dass die PTM-Anreicherung mit einem Topf ähnlich wie die Single-PTM-Anreicherungs-Workflows abspielte. Dies galt auch für die Peptid- und Fragment-Korrelationen. Die gleiche Beobachtung wurde für alle drei Korrelationen beim Vergleich von Ein-Topf mit serieller PTM-Anreicherung durchgeführt.
Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, faszinierende biologische Einblicke in PTM-Übergespräche auf schnelle und kostengünstige Weise zu machen. Die DIA-Komponente des Workflows ermöglicht es Forschern, mehr über PTMs zu verstehen, da sie Informationen über die Standortlokalisierung liefert und Herausforderungen wie die geringe Auslastung von PTMs vor Ort bewältigt. Vorläuferionen werden mit DDA tendenziell ausgeschlossen, was besonders wichtig ist, wenn ptMs untersucht werden, da die Auslastung der Standorte oft so niedrig ist, dass diese Peptide nicht für MS/MS ausgewählt werden, aber dennoch wichtige Informationen enthalten. Nachholexperimente könnten durchgeführt werden, um die Obergrenze zu bewerten, wie viele PTMs mit dieser Methode gleichzeitig angereichert werden können. Eine zukünftige Verbesserung dieses Workflows kann die Entwicklung fortschrittlicherer Softwareplattformen umfassen, um die Analyse der Standortlokalisierung und der Auslastung der PTM-Standorte weiter zu automatisieren.
The authors have nothing to disclose.
Wir würdigen die Unterstützung durch den NIH Shared Instrumentation Grant für das TripleTOF-System am Buck Institute (1S10 OD016281). Diese Arbeit wurde auch vom National Institute of Allergy and Infectious Disease (R01 AI108255 bis B.S.) und dem National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R24 DK085610 an Eric Verdin; R01 DK090242 an Eric Goetzman). X.X. wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health (NIH-Stipendium T32GM8806, an Judith Campisi und Lisa Ellerby) unterstützt, N.B. wurde durch ein Postdoktorandenstipendium der Glenn Foundation for Medical Research unterstützt.
1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408 | |
Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 36XL66 | |
Bioruptor sonicator | Diagenode, Denville, NJ, USA | B01020001 | |
C18 pre-column chip (200 µm x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 5015841 | |
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 804-00001 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
Eppendorf Thermomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock) | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 22363352 | |
Formic acid | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507-500ML | |
Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
mapDIA | web link | software for interference removal of DIA datasets | |
Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC230-4 | |
PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser | VWR International, Radnor, PA, USA | 89204-088 | |
mProphet in Skyline | incorporated in Skyline | integrated statistical algorithms for FDR assessments | |
Oasis HLB SPE cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT094225 | cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material |
Phosphate buffered saline solution | Life Technologies | 10010023 | |
Pierce BCA Assay | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 23225 | |
ProteinPilot 5.0 – 'MS database search engine' | SCIEX, Framingham, MA, USA | software download SCIEX | MS database search engine |
PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764 | Cell Signaling Technology | 13764 | antibody beads for affinity enrichment |
PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416 | Cell Signaling Technology | 13416 | antibody beads for affinity enrichment |
Sequencing-grade lyophilized trypsin | Life Technologies | 23225 | |
Skyline – 'Quantitative Proteomics Software' | MacCoss lab (academic) | open source software | Quantitative Proteomics Software (academic) |
Spectronaut – 'DIA Quantitative Analysis Software' | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization |
Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | instrument to concentrate liquid volume of samples |
TissueLyser II | Qiagen, Hilden, Germany | 85300 | instrument for efficient lysis of tissue |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508-1L | |
TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer | SCIEX, Framingham, MA, USA | Per quote | high resolution mass spectrometer |
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | Model #845 | chromatographic separation system |
Urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
Water, Burdick and Jackson LC-MS | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 600-30-76 | |
ZipTip C18 Pipette Tips, P10 | Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL | ZTC18S096 | C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures |