Infezione in vivo con Leishmania amazonensis per valutare la virulenza dei parassiti nei topi

Le leishmaniosi sono malattie infettive parassitarie prevalenti in tutto il mondo che rappresentano importanti sfide nei paesi in via di sviluppo e sono riconosciute come una delle più importanti malattie tropicali trascurate dall’Organizzazione Mondiale della Sanità^1,2. Le leishmaniasi sono caratterizzate da manifestazioni cutanee, mucose e/o viscerali. Cutaneous leishmaniosi è di solito causata da L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica e L. aethiopica³. Questa forma della malattia è spesso auto-guarigione negli esseri umani a causa dell’induzione della risposta immunitaria cellulare protettiva. Tuttavia, la risposta immunitaria cellulare può fallire e la malattia può progredire nella diffusione della leishmaniosi cutanea diffusa^4,5. Non esiste un vaccino disponibile a causa della diversità tra le specie di Leishmania e ospitare le provenienze genetiche^6,7. Le opzioni di trattamento sono anche limitate in quanto la maggior parte dei farmaci attualmente disponibili sono costosi, tossici e/o possono richiedere un trattamento a lungo termine^8,9. Inoltre, ci sono state segnalazioni di resistenza ai farmaci contro i trattamenti disponibili^10,11.

L’agente causale delle leishmaniosi è il parassita protozoo Leishmania. Il parassita presenta due forme morfologiche distinte nel suo ciclo di vita: i promastigoti, la forma flagellata trovata nelle libellule; e amastigoti, la forma intracellulare trovata nei vacuoli parassitoforo dei macrofagi ospiti dei mammiferi^12,13. La capacità degli amastigoti di invadere, sopravvivere e replicarsi nonostante i meccanismi di difesa dei macrofagi dell’ospite vertebrato sono soggette a molti studi^14,15,16,17. Di conseguenza, diversi gruppi di ricerca hanno descritto i saggi di infezione da macrofagio in vitro per valutare l’impatto di specifici fattori ambientali, nonché i geni parassiti e ospiti sull’infettività dei parassiti. Questo test presenta diversi vantaggi, come la capacità di adattare gli studi a un formato ad alta produttività, un periodo di tempo relativamente più breve per ottenere risultati e un numero ridotto di animali da laboratorio sacrificati¹⁸. Tuttavia, i risultati dei test in vitro sono limitati perché non sempre replicano studi in vivo^14,19,20^,21. I saggi in vivo forniscono una panoramica fisiologica sistemica dell’interazione ospite-parassita, che non può essere completamente imitata da analisi in vitro. Ad esempio, gli studi immunologici possono essere eseguiti attraverso saggi immunohistochimici da sezioni di tessuto del piede raccolte o anche da linfonodi poplylitali per l’analisi delle cellule immunitarie recuperate²².

Gli animali sono spesso utilizzati come modello per le malattie umane nella ricerca biologica e biomedica per comprendere meglio i meccanismi fisiologici sottostanti delle malattie²³. Nel caso della leishmaniosi, il percorso, il sito o la dose di inoculazione influenzano l’esito della malattia^24,25,26,27. Inoltre, la suscettibilità e la resistenza all’infezione nell’uomo e nei topi sono altamente regolate dagli sfondi genetici dell’ospite e del parassita^{4,5,22,28,29,30,31}. I topi BALB/c sono altamente sensibili all’infezione cutanea di L. amazonensis, mostrando una rapida progressione della malattia con la diffusione dei parassiti ai linfonodi, alla milza e al fegato³². Poiché la malattia può progredire verso metastasi cutanee, l’infezione può essere fatale. Al contrario, i topi C57BL/6 spesso sviluppano lesioni croniche con carichi di parassiti persistenti nei saggi dell’infezione da L. amazonensis ³³. Di conseguenza, l’infezione da L. amazonensis con questa particolare specie di topi è stata considerata un ottimo modello per studiare le forme croniche di leishmaniosi cutanea negli esseri umani, perché imita la progressione della malattia meglio del modello^diinfezione dei topi BALB/c 5^,34.

Quindi, proponiamo che l’infezione murina in vivo sia un metodo utile per gli studi fisiologici della virulenza Leishmania applicabili alla malattia umana, consentendo una visione sistemica dell’interazione ospite-parassita. Rivisitando i saggi consolidati²², presentiamo qui un protocollo graduale compilato dell’infezione in vivo di topi C57BL/6 con L. amazonensis che comprende la differenziazione del parassita in amastigoti assici, topi pedana cutanea inoculazione, sviluppo delle lesioni, determinazione del carico di parassiti. Questo protocollo può essere adattato ad altri ceppi di topi e specie di Leishmania che causano leishmanie cutanee. In conclusione, il metodo qui presentato è fondamentale per identificare nuovi bersagli e vaccinianti-Leishmania, nonché negli studi fisiologici delle risposte immunitarie e metaboliche dell’ospite all’infezione da Leishmania.