JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Traducción Automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Inmunología y contagio

In Vivo-Infektion mit Leishmania amazonensis zur Bewertung der Parasitenvirulenz bei Mäusen

Published: February 20, 2020
doi:
10.3791/60617
, , , ,
1Department of Physiology, Institute of Bioscience,University of Sao Paulo

Summary

Hier stellen wir ein zusammengestelltes Protokoll zur Bewertung der Hautinfektion von Mäusen mit Leishmania amazonensisvor. Dies ist eine zuverlässige Methode zur Untersuchung der Virrulenz von Parasiten, die eine systemische Ansicht der Wirbeltier-Wirtsreaktion auf die Infektion ermöglicht.

Abstract

Leishmania spp. sind protozoische Parasiten, die Leishmanien verursachen, Krankheiten, die ein breites Spektrum klinischer Manifestationen von haut- bis viszeralen Läsionen darstellen. Derzeit sind schätzungsweise 12 Millionen Menschen weltweit mit Leishmania infiziert, und über 1 Milliarde Menschen sind von infektionsgefährdet. Leishmania amazonensis ist in Mittel- und Südamerika endemisch und führt in der Regel zur hautförmigen Form der Krankheit, die in einem Tiermodell direkt visualisiert werden kann. Daher sind L. amazonensis Stämme gute Modelle für kutane Leishmaniose-Studien, weil sie auch leicht in vitro kultiviert werden können. C57BL/6-Mäuse imitieren die l. amazonensisgetriebeneKrankheitsprogression, die beim Menschen beobachtet wurde, und gelten als eines der besten Mäusestämme modellieren für kutane Leishmaniose. Im Wirbeltierwirt bewohnen diese Parasiten Makrophagen trotz der Abwehrmechanismen dieser Zellen. Mehrere Studien verwenden In-vitro-Makrophagen-Infektionstests, um die Parasiteninfektiosität unter verschiedenen Bedingungen zu bewerten. Der In-vitro-Ansatz beschränkt sich jedoch auf ein isoliertes Zellsystem, das die Reaktion des Organismus außer Acht lässt. Hier stellen wir eine in vivo murinierte Infektionsmethode zusammen, die einen systemischen physiologischen Überblick über die Wirts-Parasiten-Wechselwirkung bietet. Das detaillierte Protokoll zur In-vivo-Infektion von C57BL/6-Mäusen mit L. amazonensis umfasst die Parasitendifferenzierung in infektiöse Amastigoten, Mäusefootpad-Kutane-Impfung, Läsionsentwicklung und Parasitenlastbestimmung. Wir schlagen diese etablierte Methode als die am besten geeignete Methode für physiologische Studien des Wirts Immun- und Stoffwechselreaktionen auf hautnahe Leishmaniose vor.

Introduction

Leishmanien sind weltweit weit verbreitete parasitäre Infektionskrankheiten, die in Entwicklungsländern eine wichtige Herausforderung darstellen und von der Weltgesundheitsorganisation1,2als eine der wichtigsten vernachlässigten Tropenkrankheiten anerkannt werden. Die Leishmanien sind durch haut-, schleimhaut- und/oder viszerale Manifestationen gekennzeichnet. Kutane Leishmaniose wird in der Regel durch L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica und L. aethiopica3verursacht. Diese Form der Krankheit ist oft Selbstheilung beim Menschen aufgrund der Induktion der schützenden zellulären Immunantwort. Jedoch, die zelluläre Immunantwort kann fehlschlagen, und die Krankheit kann zu verbreiten cutaneous Leishmaniasisfortschreiten 4,5. Aufgrund der Vielfalt unter den Leishmanien-Arten und dem genetischen Hintergrund der Wirtszeit gibt es keinen Impfstoff6,7. Behandlungsmöglichkeiten sind auch begrenzt, da die meisten der derzeit verfügbaren Medikamente entweder teuer, toxisch und/oder kann langfristige Behandlung erfordern8,9. Außerdem gab es Berichte über Arzneimittelresistenz entogen gegen die verfügbaren Behandlungen10,11.

Der Erreger der Leishmanien ist der protozoische Parasit Leishmanien. Der Parasit stellt zwei verschiedene morphologische Formen in seinem Lebenszyklus dar: Promastigoten, die flagellated Form in Sandfliegen gefunden; und Amastigoten, die intrazelluläre Form, die in den parasitopholen Vakuolen des Säugetierwirts Makrophagen12,13gefunden wird. Die Fähigkeit von Amastigotes, trotz der Abwehrmechanismen der Makrophagen des Wirbeltierwirts einzudringen, zu überleben und zu replizieren, unterliegt vielen Studien14,15,16,17. Daher haben mehrere Forschungsgruppen In-vitro-Makrophagen-Infektionstests beschrieben, um die Auswirkungen spezifischer Umweltfaktoren sowie von Parasiten- und Wirtsgenen auf die Parasiteninfektiosität zu bewerten. Dieser Test bietet mehrere Vorteile, wie die Fähigkeit, Studien an ein Format mit hohem Durchsatz anzupassen, einen relativ kürzeren Zeitraum, um Ergebnisse zu erzielen, und eine geringere Anzahl von Labortieren, die18geopfert wurden. Die Ergebnisse von In-vitro-Assays sind jedoch begrenzt, da sie nicht immer in vivo-Studien14,19,20,21replizieren. In-vivo-Assays bieten einen systemischen physiologischen Überblick über die Wirts-Parasiten-Interaktion, die durch In-vitro-Assays nicht vollständig nachgeahmt werden kann. Zum Beispiel können immunologische Studien durch immunhistochemische Assays aus gesammelten Fußpolstergewebeabschnitten oder sogar von poplitealen Lymphknoten zur Analyse der wiedergewonnenen Immunzellen durchgeführt werden22.

Tiere werden oft als Modell für menschliche Krankheiten in der biologischen und biomedizinischen Forschung verwendet, um die zugrunde liegenden physiologischen Mechanismen der Krankheiten besser zu verstehen23. Im Falle der Leishmaniose beeinflussen die Route, der Ort oder die Dosis der Impfung das Krankheitsergebnis24,25,26,27. Darüber hinaus werden Anfälligkeit und Resistenz gegen die Infektion bei Menschen und Mäusen stark durch den genetischen Hintergrund des Wirts und Parasiten4,5,22,28,29,30,31reguliert. BALB/c-Mäuse sind sehr anfällig für L. amazonensis kutane Infektionen, die ein schnelles Krankheitsverlauf mit der Verbreitung der Parasiten an die Lymphknoten, Milz und Leber32zeigen. Da die Krankheit zu kutanen Metastasen fortschreiten kann, kann die Infektion tödlich sein. Im Gegensatz dazu entwickeln C57BL/6-Mäuse häufig chronische Läsionen mit anhaltenden Parasitenbelastungen in L. amazonensis-Infektions-Assays 33. Dabei wurde eine L. amazonensis-Infektion mit dieser speziellen Mausart als ein ausgezeichnetes Modell zur Untersuchung chronischer Formen der hautnaheleishmaniosen Beim Menschen angesehen, da sie das Krankheitsverlaufbesser imitiert als das BALB/c-Mäuseinfektionsmodell5,34.

Daher schlagen wir vor, dass die murine in vivo-Infektion eine nützliche Methode für Leishmanenvirulenz physiologische Studien für menschliche Krankheiten ist, die eine systemische Ansicht der Wirts-Parasiten-Interaktion ermöglichen. Bei der Begutachtung der etablierten Assays22präsentieren wir hier ein zusammengestelltes Schritt-für-Schritt-Protokoll der In-vivo-Infektion von C57BL/6-Mäusen mit L. amazonensis, das die Parasitendifferenzierung in axtische Amastigoten, Mäusefußpad-Hautimpfung, Läsionsentwicklung und Parasitenlastbestimmung umfasst. Dieses Protokoll kann an andere Mäusestämme und Leishmanienarten angepasst werden, die kutane Leishmanien verursachen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier vorgestellte Methode entscheidend für die Identifizierung neuerAnti-Leishmanie-Medikamentenziele und -impfstoffe sowie in physiologischen Studien des Wirts immun- und metabolische Reaktionen auf Leishmanien-Infektionen ist.

Protocol

Alle experimentellen Verfahren wurden vom Tierpflege- und Verwendungsausschuss des Instituts für Biowissenschaften der Universität Von Sao Paulo (CEUA 342/2019) genehmigt und in Übereinstimmung mit den Empfehlungen und den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren des Bundesstaates Sao Paulo (Lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) und der brasilianischen Regierung (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Alle in den Abschnitten 1-5 beschriebenen Schritte sollten aseptisch in laminaren Strömungsschränken du…

Representative Results

Leishmania protozoan Parasiten existieren in zwei Entwicklungsformen während ihres Lebenszyklus in wirbellosen und Wirbeltier wirte: Promastigoten, die proliferative Formen im Lumen der weiblichen Sandfliege gefunden; und Amastigoten, die proliferativen Formen, die in den parasitophorischen Vakuolen der Säugetier-Wirtszellen gefunden werden. Promastigoten haben einen langgestreckten Körper von etwa 1,5 m Breite und 20 m Länge, wobei ein Flagellum typischerweise aus der vorder…

Discussion

Der in diesem Protokoll beschriebene In-vivo-Infektionstest ermöglicht es jedem Forscher, in vivo kutane Leishmaniose unter Berücksichtigung der Wirts-Parasiten-Interaktion in einem systemischen Szenario zu bewerten. Diese Assays wurden von vielen Gruppen22,24,27,29,31,32,34,<su…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Prof. Dr. Niels Olsen Saraiva Cémara vom Tierzentrum des Instituts für Biomedizinische Wissenschaften der Universität von Sao Paulo für die Unterstützung und Prof. Dr. Silvia Reni Uliana für die Bereitstellung der Glasgewebemühle. Diese Arbeit wurde von der Sao Paulo Research Foundation (FAPESP – MFLS’ Grant 2017/23933-3) unterstützt.

Materials

96-well plate Greiner bio-ne 655180 A flat-bottom plate for limiting dilution assay
adenine Sigma A8626 Supplement added to M199 cell culture media
caliper Mitutoyo 700-118-20 A caliper to measure the thickness of footpad
cell culture flask Corning 353014 A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite
centrifuge Eppendorf 5804R An equipament used for separating samples based on its density
CO2 incubator 34 °C Thermo Scientific 3110 An incubator for amastigotes differentiation
ethanol Merck K50237083820 A disinfectant for general items
fetal bovine serum Gibco 12657-029 Supplement added to M199 cell culture media
glass tissue grinder tube Thomas Scientific 3431 E04 A tube to collect and disrupt infected footpad tissue
glucose Synth G1008.01.AH Supplement added to M199 cell culture media
GraphPad Prism Software GraphPad A software used to plot the data and calculate statistical significance
hemin Sigma H-2250 Supplement added to M199 cell culture media
HEPES Promega H5303 Supplement added to M199 cell culture media
incubator 25 °C Fanem 347CD An incubator for promastigotes cultivation
inverted microscope Nikon TMS An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures
isoflurane An inhalant anesthetics for mice (3-5%)
laminar flow cabinet Veco VLFS-09 A biosafety cabinet used for aseptical work area
M199 cell culture media Gibco 31100-035 A cell culture media for Leishmania cultivation
microcentrifuge tube Axygen MCT150C A microtube used for sample collection, processing and storage
multichanel pipette Labsystems F61978 A multichannel pipette used for limiting dilution assay
NaHCO3 Merck 6329 Supplement added to M199 cell culture media
NaOH Sigma S8045 Supplement added to M199 cell culture media
Neubauer chamber HBG 2266 A hemocytometer to count the parasite suspension
optical microscope Nikon E200 An optical equipament used to count parasite
parafilm Bemis 349 A flexible and resistant plastic to seal the plate
penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Supplement added to M199 cell culture media
Petri dishes TPP 93100 A sterile dish to dissect the footpad tissue
pipetman kit Gilson F167360 A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000)
scale Quimis BG2000 An equipament used to weigh collected footpad lesions
scalpel Solidor 10237580026 A scalpel to cut and collect footpad tissue
serological pipette 10 mL Nest 327001 A sterile pipette used for transfering mililiter volumes
tips Axygen A pipette tip used for transfering microliter volumes
Trypan blue Gibco 15250-061 A dye used to count viable parasites
trypticase peptone Merck Supplement added to M199 cell culture media
tuberculin syringe BD 305945 A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PloS One. 7 (5), e35671 (2012).
  2. Ashford, R. W. The leishmaniases as emerging and reemerging zoonoses. International Journal for Parasitololy. 30 (12-13), 1269-1281 (2000).
  3. Burza, S., Croft, S. L., Boelaert, M. Leishmaniasis. Lancet. 392 (10151), 951-970 (2018).
  4. Scorza, B. M., Carvalho, E. M., Wilson, M. E. Cutaneous Manifestations of Human and Murine Leishmaniasis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), e1296 (2017).
  5. Afonso, L. C., Scott, P. Immune responses associated with susceptibility of C57BL/10 mice to Leishmania amazonensis. Infection and Immunity. 61 (7), 2952-2959 (1993).
  6. Khamesipour, A., Rafati, S., Davoudi, N., Maboudi, F., Modabber, F. Leishmaniasis vaccine candidates for development: a global overview. Indian Journal of Medical Research. 123 (3), 423-438 (2006).
  7. Kumar, R., Engwerda, C. Vaccines to prevent leishmaniasis. Clinical & Translational Immunology. 3 (3), e13 (2014).
  8. Murray, H. W., Berman, J. D., Davies, C. R., Saravia, N. G. Advances in leishmaniasis. Lancet. 366 (9496), 1561-1577 (2005).
  9. Hotez, P. J., Bottazzi, M. E., Franco-Paredes, C., Ault, S. K., Periago, M. R. The neglected tropical diseases of Latin America and the Caribbean: a review of disease burden and distribution and a roadmap for control and elimination. PLoS Neglected Tropical Diseases. 2 (9), e300 (2008).
  10. Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. Drug resistance in leishmaniasis. Clinical Microbiology Reviews. 19 (1), 111-126 (2006).
  11. Ponte-Sucre, A., et al. Drug resistance and treatment failure in leishmaniasis: A 21st century challenge. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), e0006052 (2017).
  12. Teixeira, D. E., et al. The cell biology of Leishmania: how to teach using animations. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003594 (2013).
  13. Sunter, J., Gull, K. Shape, form, function and Leishmania pathogenicity: from textbook descriptions to biological understanding. Open Biology Journal. 7 (9), 170165 (2017).
  14. Laranjeira-Silva, M. F., et al. A MFS-like plasma membrane transporter required for Leishmania virulence protects the parasites from iron toxicity. PLoS Pathogens. 14 (6), e1007140 (2018).
  15. Aoki, J. I., et al. L-arginine availability and arginase activity: Characterization of amino acid permease 3 in Leishmania amazonensis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), e0006025 (2017).
  16. Probst, C. M., et al. A comparison of two distinct murine macrophage gene expression profiles in response to Leishmania amazonensis infection. BMC Microbiology. 12, 22 (2012).
  17. Dillon, L. A., et al. Simultaneous transcriptional profiling of Leishmania major and its murine macrophage host cell reveals insights into host-pathogen interactions. BMC Genomics. 16, 1108 (2015).
  18. Sarkar, A., Khan, Y. A., Laranjeira-Silva, M. F., Andrews, N. W., Mittra, B. Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites. Journal of Visualized Experiments. (133), e57486 (2018).
  19. Mittra, B., Laranjeira-Silva, M. F., Miguel, D. C., Perrone Bezerra de Menezes, J., Andrews, N. W. The iron-dependent mitochondrial superoxide dismutase SODA promotes. The Journal of Biological Chemistry. 292 (29), 12324-12338 (2017).
  20. Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 ferric iron reductase of Leishmania amazonensis is essential for the generation of infective parasite forms. The Journal of Biological Chemistry. 286 (26), 23266-23279 (2011).
  21. Laranjeira-Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PloS One. 7 (3), e34022 (2012).
  22. Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Current Protocols in Immunology. , (1998).
  23. Andersen, M. L., Winter, L. M. F. Animal models in biological and biomedical research – experimental and ethical concerns. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 91, e20170238 (2019).
  24. Ribeiro-Gomes, F. L., et al. Site-dependent recruitment of inflammatory cells determines the effective dose of Leishmania major. Infection and Immunity. 82 (7), 2713-2727 (2014).
  25. Mahmoudzadeh-Niknam, H., Khalili, G., Abrishami, F., Najafy, A., Khaze, V. The route of Leishmania tropica infection determines disease outcome and protection against Leishmania major in BALB/c mice. The Korean Journal of Parasitology. 51 (1), 69-74 (2013).
  26. Oliveira, D. M., et al. Evaluation of parasitological and immunological parameters of Leishmania chagasi infection in BALB/c mice using different doses and routes of inoculation of parasites. Parasitology Research. 110 (3), 1277-1285 (2012).
  27. Côrtes, D. F., et al. Low and high-dose intradermal infection with Leishmania major and Leishmania amazonensis in C57BL/6 mice. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 105 (6), 736-745 (2010).
  28. Blackwell, J. M., et al. Genetics and visceral leishmaniasis: of mice and man. Parasite Immunology. 31 (5), 254-266 (2009).
  29. Loeuillet, C., Bañuls, A. L., Hide, M. Study of Leishmania pathogenesis in mice: experimental considerations. Parasites & Vectors. 9, 144 (2016).
  30. Alexander, J., Brombacher, F. T Helper1/T Helper2 Cells and Resistance/Susceptibility to Leishmania Infection: Is This Paradigm Still Relevant?. Frontiers in Immunology. 3, 80 (2012).
  31. Sacks, D., Noben-Trauth, N. The immunology of susceptibility and resistance to Leishmania major in mice. Nature Reviews Immunology. 2 (11), 845-858 (2002).
  32. Bogdan, C., et al. Experimental Cutaneous Leishmaniasis: Mouse Models for Resolution of Inflammation Versus Chronicity of Disease. Methods in Molecular Biology. 1971, 315-349 (2019).
  33. Jones, D. E., Ackermann, M. R., Wille, U., Hunter, C. A., Scott, P. Early enhanced Th1 response after Leishmania amazonensis infection of C57BL/6 interleukin-10-deficient mice does not lead to resolution of infection. Infection and Immunity. 70 (4), 2151-2158 (2002).
  34. Velasquez, L. G., et al. Distinct courses of infection with Leishmania (L.) amazonensis are observed in BALB/c, BALB/c nude and C57BL/6 mice. Parasitology. 143 (6), 692-703 (2016).
  35. de Menezes, J. P., et al. Leishmania infection inhibits macrophage motility by altering F-actin dynamics and the expression of adhesion complex proteins. Cellular Microbiology. 19 (3), 1266 (2017).
  36. Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathogens. 12 (1), e1005340 (2016).
  37. Zilberstein, D., Nitzan Koren, R. Host-Free Systems for Differentiation of Axenic Leishmania. Methods in Molecular Biology. 1971, 1-8 (2019).
  38. Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annual Review of Microbiology. 48, 449-470 (1994).
  39. Dumetz, F., et al. Modulation of Aneuploidy in Leishmania donovani during adaptation to different in vitro and in vivo environments and its impact on gene expression. MBio. 8 (3), e00599-e00517 (2017).
  40. Sinha, R., et al. Genome Plasticity in Cultured Leishmania donovani: Comparison of Early and Late Passages. Frontiers in Microbiology. 9, 1279 (2018).
  41. Magalhães, R. D., et al. Identification of differentially expressed proteins from Leishmania amazonensis associated with the loss of virulence of the parasites. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (4), e2764 (2014).
  42. Lei, S. M., Romine, N. M., Beetham, J. K. Population changes in Leishmania chagasi promastigote developmental stages due to serial passage. Journal of Parasitology. 96 (6), 1134-1138 (2010).
  43. Ali, K. S., Rees, R. C., Terrell-Nield, C., Ali, S. A. Virulence loss and amastigote transformation failure determine host cell responses to Leishmania mexicana. Parasite Immunology. 35 (12), 441-456 (2013).
  44. Rebello, K. M., et al. Leishmania (Viannia) braziliensis: influence of successive in vitro cultivation on the expression of promastigote proteinases. Experimental Parasitology. 126 (4), 570-576 (2010).
  45. Titus, R. G., Marchand, M., Boon, T., Louis, J. A. A limiting dilution assay for quantifying Leishmania major in tissues of infected mice. Parasite Immunology. 7 (5), 545-555 (1985).
  46. Lima, H. C., Bleyenberg, J. A., Titus, R. G. A simple method for quantifying Leishmania in tissues of infected animals. Parasitology Today. 13 (2), 80-82 (1997).
  47. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , (1997).
  48. Sacks, D., Kamhawi, S. Molecular aspects of parasite-vector and vector-host interactions in leishmaniasis. Annual Review of Microbiology. 55, 453-483 (2001).
  49. Reimão, J. Q., et al. Parasite burden in Leishmania (Leishmania) amazonensis-infected mice: validation of luciferase as a quantitative tool. Journal of Microbiological Methods. 93 (2), 95-101 (2013).
  50. Buckley, S. M., et al. In vivo bioimaging with tissue-specific transcription factor activated luciferase reporters. Scientific Reports. 5, 11842 (2015).
  51. Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. Journal of Visualized Experiments. (41), e1980 (2010).
  52. Roberts, S. C., et al. Arginase plays a pivotal role in polyamine precursor metabolism in Leishmania. Characterization of gene deletion mutants. The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23668-23678 (2004).
  53. Boitz, J. M., et al. Arginase Is Essential for Survival of Leishmania donovani Promastigotes but Not Intracellular Amastigotes. Infection and Immunity. 85 (1), e00554 (2017).
  54. Rosas, L. E., et al. Genetic background influences immune responses and disease outcome of cutaneous L. mexicana infection in mice. International Immunology. 17 (10), 1347-1357 (2005).
  55. Belkaid, Y., et al. Development of a natural model of cutaneous leishmaniasis: powerful effects of vector saliva and saliva preexposure on the long-term outcome of Leishmania major infection in the mouse ear dermis. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1941-1953 (1998).
  56. Titus, R. G., Ribeiro, J. M. Salivary gland lysates from the sand fly Lutzomyia longipalpis enhance Leishmania infectivity. Science. 239 (4845), 1306-1308 (1988).
  57. Lima, H. C., Titus, R. G. Effects of sand fly vector saliva on development of cutaneous lesions and the immune response to Leishmania braziliensis in BALB/c mice. Infection and Immunity. 64 (12), 5442-5445 (1996).
  58. Theodos, C. M., Ribeiro, J. M., Titus, R. G. Analysis of enhancing effect of sand fly saliva on Leishmania infection in mice. Infection and Immunity. 59 (5), 1592-1598 (1991).
  59. Kaur, S., et al. Effect of dose and route of inoculation on the generation of CD4+ Th1/Th2 type of immune response in murine visceral leishmaniasis. Parasitology Research. 103 (6), 1413-1419 (2008).
  60. Rolão, N., Melo, C., Campino, L. Influence of the inoculation route in BALB/c mice infected by Leishmania infantum. Acta Tropica. 90 (1), 123-126 (2004).
  61. Kébaïer, C., Louzir, H., Chenik, M., Ben Salah, A., Dellagi, K. Heterogeneity of wild Leishmania major isolates in experimental murine pathogenicity and specific immune response. Infection and Immunity. 69 (8), 4906-4915 (2001).
  62. Baldwin, T. M., Elso, C., Curtis, J., Buckingham, L., Handman, E. The site of Leishmania major infection determines disease severity and immune responses. Infection and Immunity. 71 (12), 6830-6834 (2003).
  63. Aoki, J. I., et al. RNA-seq transcriptional profiling of Leishmania amazonensis reveals an arginase-dependent gene expression regulation. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), e0006026 (2017).
  64. Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. International Journal for Parasitology. 35 (7), 757-764 (2005).
  65. Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Experimental Parasitology. 99 (2), 97-103 (2001).
  66. Aoki, J. I., Laranjeira-Silva, M. F., Muxel, S. M., Floeter-Winter, L. M. The impact of arginase activity on virulence factors of Leishmania amazonensis. Current Opinion in Microbiology. 52, 110-115 (2019).
  67. Jackson, A. P. The evolution of amastin surface glycoproteins in trypanosomatid parasites. Molecular Biology and Evolution. 27 (1), 33-45 (2010).
  68. Rochette, A., et al. Characterization and developmental gene regulation of a large gene family encoding amastin surface proteins in Leishmania spp. Molecular and Biochemical Parasitology. 140 (2), 205-220 (2005).
  69. Rochette, A., Raymond, F., Corbeil, J., Ouellette, M., Papadopoulou, B. Whole-genome comparative RNA expression profiling of axenic and intracellular amastigote forms of Leishmania infantum. Molecular and Biochemical Parasitology. 165 (1), 32-47 (2009).
  70. Schneider, P., Rosat, J. P., Bouvier, J., Louis, J., Bordier, C. Leishmania major: differential regulation of the surface metalloprotease in amastigote and promastigote stages. Experimental Parasitology. 75 (2), 196-206 (1992).
  71. Ji, J., Sun, J., Qi, H., Soong, L. Analysis of T helper cell responses during infection with Leishmania amazonensis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 66 (4), 338-345 (2002).
  72. Ji, J., Sun, J., Soong, L. Impaired expression of inflammatory cytokines and chemokines at early stages of infection with Leishmania amazonensis. Infection and Immunity. 71 (8), 4278-4288 (2003).
  73. Felizardo, T. C., Toma, L. S., Borges, N. B., Lima, G. M., Abrahamsohn, I. A. Leishmania (Leishmania) amazonensis infection and dissemination in mice inoculated with stationary-phase or with purified metacyclic promastigotes. Parasitology. 134 (12), 1699-1707 (2007).
  74. Laranjeira-Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Floeter-Winter, L. M., Markus, R. P. Melatonin attenuates Leishmania (L.) amazonensis infection by modulating arginine metabolism. Journal of Pineal Research. 59 (4), 478-487 (2015).

Tags

Leishmania AmazonensisIn Vivo InfectionVirulenceCutaneous LeishmaniasisMouse ModelPromastigotesAmastigotesSubplantar InjectionLesion ProgressionParasite Quantification

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Aoki, J. I., Hong, A., Zampieri, R. A., Floeter-Winter, L. M., Laranjeira-Silva, M. F. In Vivo Infection with Leishmania amazonensis to Evaluate Parasite Virulence in Mice. J. Vis. Exp. (156), e60617, doi:10.3791/60617 (2020).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image