Summary

Un modèle d’inoculation retardée de pseudomonas chronique infection de blessure d’aeruginosa

Published: February 20, 2020
doi:

Summary

Nous décrivons un protocole retardé d’inoculation pour produire des infections chroniques de blessure dans les souris immunocompétentes.

Abstract

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) est un agent pathogène nosocomial majeur de plus en plus pertinent pour la santé humaine et la maladie, en particulier dans le cadre d’infections chroniques des plaies chez les patients diabétiques et hospitalisés. Il est urgent de mettre au point des modèles d’infection chronique pour aider à l’étude de la pathogénie des plaies et au développement de nouvelles thérapies contre cet agent pathogène. Ici, nous décrivons un protocole qui emploie l’inoculation retardée 24 heures après la blessure excisional pleine épaisseur. L’infection de la matrice provisoire de blessure présente à ce moment-là prédise le dégagement ou la diffusion rapide de l’infection et établit plutôt l’infection chronique durant 7-10 jours sans avoir besoin d’implantation de matériaux étrangers ou de suppression immunitaire. Ce protocole imite un cours temporel typique de l’infection postopératoire chez l’homme. L’utilisation d’une souche luminescente de P. aeruginosa (PAO1:lux) permet l’évaluation quotidienne quantitative de la charge bactérienne pour des infections de blessure de P. aeruginosa. Ce nouveau modèle peut être un outil utile dans l’étude de la pathogénie bactérienne et le développement de nouvelles thérapies pour les infections chroniques de plaie de P. aeruginosa.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) est une bactérie en forme de tige Gram-négative avec une pertinence croissante pour la santé humaine et la maladie. Il est responsable de la morbidité et de la mortalité étendues dans les arrangements nosocomiaux, particulièrement impliquant des infections de blessure dans les patients immunocompromis1,2. L’émergence de souches multirésistantes de cet agent pathogène a donné une impulsion supplémentaire pour l’investigation sur les facteurs contribuant à la virulence de P. aeruginosa, les mécanismes de la résistance aux antibiotiques De P. aeruginosa, et de nouvelles méthodes pour la prévention et le traitement de cette infection mortelle3. En tant que tel, le besoin de modèles animaux de l’infection chronique des plaies comme outils pour étudier ces questions de recherche n’a jamais été aussi grand.

Malheureusement, de nombreux modèles animaux de l’infection à P. aeruginosa ont tendance à simuler une infection aigue avec une résolution rapide de l’infection ou un déclin rapide dû à la septicémie4,5, qui ne simule pas adéquatement la nature souvent chronique de ces infections. Pour remédier à cet inconvénient, certains modèles utilisent l’implantation de corps étrangers tels que les perles d’agar, les implants en silicone, ou les gels d’alginate6,7,8. D’autres modèles utilisent des souris qui sont immunocompromised en raison de l’âge avancé, l’obésité, ou le diabète, ou par des moyens pharmacologiques tels que la neutropénie induite par cyclophophosphamide9,10,11,12. Cependant, l’utilisation de matériaux étrangers ou d’hôtes immunodéprimés modifie probablement le processus inflammatoire local, ce qui rend difficile d’acquérir une compréhension de la physiopathologie impliquée dans les infections chroniques des plaies chez les hôtes avec un système immunitaire autrement normal.

Nous avons développé un modèle chronique de P. aeruginosa infection de blessure chez les souris qui implique l’inoculation retardée avec des bactéries après blessure excisional. L’inoculation retardée permet des expériences évaluant la charge bactérienne s’étendant jusqu’à au moins 7 jours. Ce modèle ouvre de nouvelles possibilités d’étudier à la fois la pathogénie et les nouveaux traitements des infections chroniques de P. aeruginosa.

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université Stanford. 1. Préparation et croissance des bactéries Effectuer tous les travaux avec P. aeruginosa et les animaux avec des précautions BSL-2 selon le comité institutionnel de biosécurité du chercheur et les lignes directrices du comité d’utilisation des animaux. Faites toutes les étapes décrites ici impliquant <e…

Representative Results

À l’aide d’une souche luminescente de PAO1 avec un plasmide codant le système de journaliste luxABCDE (PAO1:lux), nous avons effectué des blessures excisionales sur des souris, inoculé ces blessures avec p. aeruginosa planctonique 24 h plus tard, et mesuré la charge bactérienne au fil du temps(Figure 1 et Figure 2). Une image représentative obtenue à l’aide d’un système optique d’imagerie démontre que…

Discussion

Nous avons développé un nouveau modèle retardé d’infection de blessure de P. aeruginosa d’inoculation. La stratégie de retarder l’inoculation avec des bactéries jusqu’à 24 h après la blessure excisional permet l’évaluation des infections de blessure sur une période d’une semaine. En utilisant une souche luminescente de P. aeruginosa, il est possible de suivre la progression de l’infection tout au long du cours de l’infection. Le cours plus long de l’infection par rapport à d…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Le vecteur de construction luminescente pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 était un cadeau gracieux de J. Hardy. Des schémas ont été créés avec BioRender.com. Nous remercions le laboratoire de G. Gurtner pour leurs conseils sur le modèle d’infection des plaies. Nous remercions également T. Doyle du Stanford Center for Innovation in In Vivo Imaging pour son expertise technique. Ce travail a été soutenu par des subventions R21AI133370, R21AI133240, R01AI12492093, et des subventions de Stanford SPARK, le Falk Medical Research Trust et la Cystic Fibrosis Foundation (CFF) à P.L.B. C.R.D a été soutenu par T32AI007502. Une bourse d’études supérieures Gabilan Stanford pour les sciences et l’ingénierie et une bourse d’études supérieures interdisciplinaires Lubert Stryer Bio-X Stanford ont soutenu J.M.S.

Materials

0.9% Sodium Chloride injection Hospira 2484457
18 G x 1 sterile needle BD 305195
25 G x 1 1/5 sterile needle BD 305127
Alcohol swab BD 326895
Aura Imaging Software Spectral Instruments Imaging n/a
Betadine Purdue Frederick Company 19-065534
Buprenorphine SR LAB Zoopharm n/a
C57BL/6J male mice The Jackson Laboratory 000664
Disposable biopsy punch, 6mm Integra 33-36
Fine scissors – Tungsten Carbide Fine Science Tools 14568-09
Glass Bead Dry Sterilizer Harvard Apparatus 61-0183
Granulated Agar Fisher BioReagents BP9744
Heating Pad Milliard 804879481218
Insulin syringe with 28 G needle BD 329461
Lago X Imaging System Spectral Instruments Imaging n/a
LB broth Fisher BioReagents BP1426
Leur-Lok 1 mL syringe BD 309628
Mini Arco Animal Trimmer Wahl Professional 919152
Nair Hair Removal Lotion with Baby Oil Church and Dwight n/a Available at any pharmacy
Octagon Forceps Fine Science Tools 11041-08
Petri dish Falcon 351029
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1x Corning 21-040-CV
Press and Seal Cling Wrap Glad n/a
SafetyGlide Insulin syringe with 30 G needle BD 305934
Safetyglide Insulin syringe, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW BD 305934
Scale Ohaus Scout Pro SP202
Supplical Nutritional Supplement Henry Schein Animal Health 29908
Tegaderm, 6 cm x 7 cm 3M 1624W

Referencias

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Citar este artículo
de Vries, C. R., Sweere, J. M., Ishak, H., Sunkari, V., Bach, M. S., Liu, D., Manasherob, R., Bollyky, P. L. A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (156), e60599, doi:10.3791/60599 (2020).

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