在这里,我们描述了体外乳腺圈自我更新定量测定结果的实现和解释。
乳腺的特点是广泛的再生能力,因为它经历了女性整个生命周期的大规模荷尔蒙变化。乳腺干细胞的作用在生理/发育方面和乳房致癌方面都有着广泛的研究。在这方面,专注于MaSC属性的外生研究非常抢手。乳腺文化是器官形成的代用品,已成为基础和转化研究的宝贵工具。在这里,我们提出了一个详细的协议,为生成鼠原乳腺圈培养和MaSC生长特性的定量。该协议包括乳腺的收集和消化,原发性乳腺上皮细胞的分离(MECs),建立原发性乳腺培养物,连续传递,对乳腺圈生长参数进行定量和结果解释。例如,我们介绍了低水平组织Myc表达对正常MECs的影响,导致自我更新和扩散的增加。
乳腺上皮茎和祖细胞的分离和体外培养已成为了解其在乳腺细胞生物学中特性的关键。优雅的系系追踪和序列移植检测使干细胞(SC)和其他组织子集的研究能够结合其体内利基进行。但是,这种方法非常耗时,需要生成报告器鼠标模型1、2、3、4、5。因此,在体外培养和繁殖乳腺干细胞(MaCs),同时保留关键的干细胞特征,即自我更新和分化能力,是该领域最大的挑战之一。在过去的几年里,乳腺圈测定被广泛用于模拟正常的乳腺组织和乳腺癌的生长,量化正常或癌症的CS(CSCs),并评估他们作为代孕报告人在其各自体内活动6,7,8,9,10,11的自我更新能力。
乳腺圈测定是一种高效且具有成本效益的方法,在非粘附条件下培养新分离的乳腺上皮细胞(MECs),前提是只有MaCs才能存活并形成悬浮球体,而所有其他细胞类型将死于阿诺基斯。此外,在连续的非粘附段落中形成几代乳腺球的能力,与马华会第6、9、11号的自我更新能力有关。在这里,我们描述了一个定量的乳腺圈测定的详细协议,它最初由Dontu和他的同事7开发,作为开创性神经球测定12的修改,在非粘附的、无血清的条件下,通过添加适当的生长因子7,12,使假定的SC生长。
在这里,我们描述了一个在体外对MaSC生长特性进行定量描述的协议。例如,我们介绍了低水平组织Myc表达对正常鼠马Cs的影响。但是,这种方法同样适用于各种上下文。人类或鼠原细胞,以及已建立的细胞系,可以在锚固独立条件下培养,以建立可以连续传递的乳腺圈培养物。基因过度表达和RNA干扰可以很容易地引入协议,在第一个段落的末尾(步骤3.5之后)增加了病毒转导步骤。或者,细胞可以在粘附中感染,然后被镀为乳腺球体。
这里提出的测定的一个关键方面是播种细胞密度,它应该足够低,以避免聚集的产生干扰对结果16,17的解释。乳腺球的形态可以信息化,以解决这种歧义。每个段落的末尾只应列举紧凑的圆形球体。应考虑到球体的循环和尺寸。使用 DIA 的自动化流程,以客观和绝对的方式确保使用适当的阈值。通常,祖细胞会形成细胞结构或较小的细胞簇,这些细胞群应排除在乳腺圈计数之外。根据经验,我们使用直径为 100 μm 的阈值。最后,应注意避免将完整或完全分离的乳腺从一条通道转移到下一条通道。另一方面,过量的移液会导致细胞死亡增加。因此,如果遇到这样的困难,我们建议使用温和的胰蛋白酶化或Accutase治疗,并通过40μm滤网分离球,以确保产生单细胞悬浮液。
球体形成效率(SFE)已被交替使用,作为在乳腺圈培养物中的SC或CSC定量前体的替代物。SFE确实是一个特定细胞群中干细胞的量度。然而,它代表一种不太认真的做法,因为它只在不同的时间点提供信息。相反,计算累积球数和生成累积增长曲线,可以推断培养物从初始细胞播种步骤到培养物耗尽,或者,在未朽培养物的情况下,可以推断所需的段落数。对生长特性的评估允许通过系数 R2评估指数增长的偏差,并在第二步评估 GR 值本身。
重要的是,累积的乳腺生长曲线可用于评估小分子抑制剂或其他化疗药物在CSC级别6,11中选择性的效果。与正常原发性乳腺球相反,肿瘤乳腺球体在5-7个通道中功能性耗尽,肿瘤乳腺球体倾向于无限扩张。此功能链接到无限的 CSC 自我更新能力。通过肿瘤细胞和乳腺圈生长曲线的生成,可以分离对增殖和CSC自我更新的影响。CSC特异性效应预计将导致累积乳腺球增长率的下降,无论是否对累积细胞增长率影响6,11。
最后,另一个感兴趣的领域是成人组织SC重新编程。完全生长的乳腺球体由表型异质细胞群组成,其中只有一小部分保留类似干细胞的特征,包括乳腺球启动能力和移植体内6、9、11、18、19时的乳腺再生。因此,可以使用体外标签保留测定剂6、9、11或前体,使用已建立的表面标记2、3进行分离。值得注意的是,乳腺祖体不能存活,无法形成乳腺球。强制执行的Myc表达已被证明赋予乳腺圈启动潜力,作为PKHneg11被隔离的乳腺祖传,导致一种可以无限期地传递的文化的产生。同样,对生理重编程的负稳压器的干扰也可以使用相同的测定测试。在这种情况下,可能会出现一个常见问题是单元输入的数量有限。如果细胞输入低于10,000个细胞,我们建议在24孔板(最多5,000个活细胞/mL)中播种。然而,锚固独立培养条件可以证明过于苛刻,无法重新编程评分,尤其是在重新编程效果不立的情况下。在这种情况下,使用支持矩阵和三维有机体培养物可能更合适20。
总体而言,乳腺球测定是一种经济高效的选择,可以很容易地用于在正常和肿瘤MEC人群中对类似茎的特性进行评分。本议定书采用的定量方法有助于在不同条件下进行或受到各种刺激的培养物之间的比较。严格遵循后,它提供了一个相对简单的外生模型系统,允许定义体内茎特性的多个参与者脱钩,从而提供了更详细的机械研究的可能性。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢布鲁诺·阿玛蒂送给罗莎26-MycER转基因小鼠模型的友好礼物。这项工作由WWCR、AIRC、ERC和意大利卫生部向P.G.P.T.V.和X.A.提供的赠款资助,由FIRC和A.S.提供FUV赠款。
ACK lysis buffer | Lonza | 10-548E | Ammonium-chloride-potassium lysis bufer, 100 mL. |
B27 | Invitrogen | 17504-044 | B27 supplement 50X (10 mL). Final concentration 2% v/v. |
bFGF | Peprotech | 100-18B | Human recombinant fibroblast growth factor – basic, 50 μg. Stock solution 100 μg/μL in Tris 5 mM pH 7.6. Final dilution 0.02% v/v. |
Collagenase | Sigma | C2674 | Collagenase from Clostridium histolyticum. Type I-A, lyophilized powder, 1 g. Stock 20,000 U/mL in DMEM. Final dilution 1% v/v. |
DMEM | Lonza | 12-614F | Dulbecco's modified Eagle's medium |
DPBS | Microgem | S17859L0615 | Dulbecco's phosphate buffered saline |
EGF | Tebu-Bio | AF-100-15 | Recombinant human epithelial growth factor. Stock solution 100 μg/mL in sterile dH2O. Final dilution 0.02% v/v. |
Glutamine | Lonza | 17-605E | L-Glutamine, 200 mM. Final dilution 1% v/v. |
Heparin | PharmaTex | 34692032 | Stock concentration 5,000 IU/mL. Final dilution 0.008% v/v. |
Hyaluronidase | Sigma | H4272 | Type IV-S, powder, 750-3,000 U/mg solid, 30 mg. Stock solution 10 mg/mL in sterile dH2O. Final dilution 1% v/v. |
Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 μg/mL. Final dilution 0.5% v/v. |
Insulin | SAFCBiosciences | 91077C | Insulin, human recombinant, dry powder, 250 mg. Stock concentration 1 mg/mL. Final dilution 0.5% v/v. |
Low attachment 6-well plates | Corning | 351146 | Sterile 6-well not treated cell culture plates with clear flat bottom and lid. |
MEBM | Lonza | CC-3151 | Mammary epithelial cell growth basal medium |
Penicllin-Streptomycin mixture | Lonza | 17-602F | Contains 10,000 U potassium penicillin and 10,000 µg streptomycin sulfate per mL in 0.85% saline. Final dilution 1% v/v. |
Poly-HEMA | Sigma | P3932 | Dissolve in 95% EtOH overnight at 55 °C. Stock concentration 12% w/v. Final dilution 1% v/v in 95% EtOH. Filter (0.22 μm) before use. |