Auflösen von Wasser, Proteinen und Lipiden aus In Vivo konfokale Raman Spectra von Stratum Corneum durch einen chemometrischen Ansatz

In klinischen Studien hat die konfokale Raman-Spektroskopie in vivo ihre einzigartige Fähigkeit zur Bestimmung der Dicke des Stratum corneum und des Wassergehalts^1,2,3,4, und die Verfolgung der Penetration von aktive Materialien topisch auf die Haut aufgetragen^5,6. Als nichtinvasiver Ansatz erkennt die konfokale Raman-Spektroskopie molekulare Signale basierend auf Schwingungsmodi. Daher ist eine Kennzeichnung nicht erforderlich⁷. Die konfokale Raman-Spektroskopie in vivo liefert chemische Informationen mit Tiefenauflösung, die auf der konfokalen Natur der Technik basieren. Diese tiefenabhängigen Informationen sind sehr nützlich bei der Untersuchung der Auswirkungen von Hautpflegeprodukten^4,8, Alterung^9,10, saisonale Veränderungen³, sowie Hautbarriere Funktionskrankheiten, wie atopische Dermatitis^11,12. Es gibt viele Informationen im hochfrequenten Bereich der konfokalen Raman-Spektroskopie (2.500–4.000 cm^-1), wo Wasser in der Region zwischen 3.250–3.550 cm^-1unterschiedliche Spitzen erzeugt. Die Raman-Spitzen von Proteinen und Lipiden, die zwischen ca. 2.800–3.000 cm^-1zentriert sind, überlappen sich jedoch, da die Signale hauptsächlich aus Methylen (-CH₂-) und Methyl (-CH₃) Gruppen¹³ . Diese überlappenden Informationen stellen eine technische Herausforderung dar, wenn relativ viele einzelne molekulare Arten erhalten werden. Peak Fitting^14,15 und selektive Spitzenposition^12,16 Ansätze wurden verwendet, um diese Herausforderung zu lösen. Für diese auf einzelnen Spitzen basierenden Methoden ist es jedoch schwierig, reine Komponenteninformationen zu extrahieren, da mehrere Raman-Spitzen aus derselben Komponente gleichzeitig ändern¹⁷. In unserer jüngsten Veröffentlichung¹⁸wurde ein MCR-Ansatz vorgeschlagen, um die reinen Komponenteninformationen aufzuklären. Mit diesem Ansatz wurden drei Komponenten (Wasser, Proteine und Lipide) aus einem großen in vivo konfokalen Raman spektroskopischen Datensatz extrahiert.

Die Durchführung großer klinischer Studien kann für Personen, die spektroskopische Daten in vivo sammeln, anspruchsvoll sein. In einigen Fällen kann die spektrale Erfassung Eine Betriebsausrüstung für viele Stunden an einem Tag erfordern und die Studie kann sich bis zu Wochen oder Monate erstrecken. Unter diesen Bedingungen können spektroskopische Daten von Gerätebetreibern generiert werden, denen das technische Know-how fehlt, um alle Quellen spektroskopischer Artefakte zu identifizieren, auszuschließen und zu korrigieren. Der resultierende Datensatz kann einen kleinen Bruchteil spektroskopischer Ausreißer enthalten, die vor der Analyse identifiziert und aus den Daten ausgeschlossen werden müssen. Dieses Papier veranschaulicht detailliert einen chemometrischen Analyseprozess, um ein klinisches Raman-Dataset zu “bereinigen”, bevor die Daten mit MCR analysiert werden. Um die Ausreißer erfolgreich zu entfernen, müssen die Arten von Ausreißern und die mögliche Ursache für die Erzeugung der Ausreißerspektren identifiziert werden. Dann kann ein spezifischer Ansatz entwickelt werden, um die gezielten Ausreißer zu entfernen. Dies erfordert Vorkenntnisse des Datensatzes, einschließlich eines detaillierten Verständnisses des Datengenerierungsprozesses und des Studiendesigns. In diesem Datensatz sind die meisten Ausreißer niedrige Signal-Rausch-Spektren und stammen hauptsächlich aus 1) Spektren, die über der Hautoberfläche gesammelt wurden (6.208 von 30.862), und 2) starkem Beitrag zum Spektrum von fluoreszierendem Raumlicht (67 von 30.862). Spektren, die über der Hautoberfläche gesammelt werden, erzeugen eine schwache Raman-Reaktion, da sich der Laserfokus der Hautoberfläche nähert und sich meist im Instrumentenfenster unter der Haut befindet. Spektren mit einem starken Beitrag von fluoreszierendem Raumlicht werden entweder durch Fehler des Gerätebedieners oder durch Subjektbewegung erzeugt, wodurch ein Zustand entsteht, in dem das konfokale Raman-Sammelfenster nicht vollständig von der Körperseite des Motivs abgedeckt ist. Obwohl diese Arten von Spektralartefakten während der spektralen Erfassung durch einen spektroskopischen Sachverständigen zum Zeitpunkt der Datenerfassung identifiziert und behoben werden konnten, wurden die in dieser Studie verwendeten geschulten Instrumentenbetreiber angewiesen, alle Daten zu sammeln, es sei denn, katastrophales Versagen beobachtet wurde. Die Aufgabe, Ausreißer zu identifizieren und auszuschließen, wird in das Datenanalyseprotokoll integriert. Das vorgelegte Protokoll wurde entwickelt, um diese Herausforderung zu lösen. Um die schwachen Signal-Rausch-Spektren über der Hautoberfläche zu adressieren, muss zuerst die Lage der Hautoberfläche bestimmt werden, um die Entfernung von Spektren zu ermöglichen, die über der Hautoberfläche gesammelt wurden. Die Lage der Hautoberfläche ist definiert als die Tiefe, in der der Raman-Laserfokusdierpunkt zur Hälfte in der Haut und zur Hälfte aus der Haut heraus ist, wie in Der Ergänzungsfigur 1dargestellt. Nach dem Entfernen von schwachen Signal-Rausch-Spektren wird eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) implementiert, um den Faktor zu extrahieren, der von fluoreszierenden Raumlichtspitzen dominiert wird. Diese Ausreißer werden basierend auf dem Score-Wert des entsprechenden Faktors entfernt.

Dieses Protokoll enthält detaillierte Informationen darüber, wie sechs Hauptkomponenten im MCR-Prozess bestimmt werden. Dies geschieht durch eine PCA-Analyse, gefolgt von einem spektralen Formvergleich zwischen den Belastungen für Modelle, die mit einer anderen Anzahl von Hauptkomponenten generiert wurden. Auch das experimentelle Verfahren zur Datenerfassung von Referenzmaterialien sowie den menschlichen Probanden wird ausführlich erläutert.