Resolvendo água, proteínas e lipídeos de in vivo confocal Raman Spectra de stratum corneum através de uma abordagem quimiométrica

Em estudos clínicos, a Espectroscopia Raman confocal in vivo demonstrou sua habilidade única para determinar a espessura do estrato córneo e o teor de água^1,2,3,4e rastrear a penetração de materiais ativos aplicados topicamente na pele^5,6. Como uma aproximação não invasora, a espectroscopia confocal de Raman detecta sinais moleculars baseados em modos vibracional. Assim, a rotulagem não é necessária⁷. A Espectroscopia Raman confocal in vivo fornece informações químicas com resolução de profundidade com base na natureza Confocal da técnica. Esta informação dependente da profundidade é muito útil em estudar os efeitos de produtos do cuidado de pele^4,8, envelhecendo^{9,10, mudanças}sazonais³, assim como doenças da função da barreira da pele, como a dermatite atópica^11,12. Há muita informação na região de alta frequência da espectroscopia confocal Raman (2500 – 4000 cm^-1), onde a água produz picos distintos na região entre 3250 – 3550 cm^-1. No entanto, os picos Raman de proteínas e lipídios, que são centralizados entre aproximadamente 2800 – 3000 cm^-1, se sobrepõem uns aos outros porque os sinais são produzidos principalmente a partir de metileno (-CH₂-) e metil (-CH₃) grupos¹³ . Esta informação sobreposta apresenta um desafio técnico ao obter quantidades relativas de espécies moleculares individuais. O encaixe máximo^14,15 e a posição de pico seletivo^12,16 aproximações foram usadas para resolver este desafio. Entretanto, é difícil para estes únicos métodos Peak-based extrair a informação componente pura porque os picos Raman múltiplos do mesmo componente mudam simultaneamente¹⁷. Em nossa recente publicação¹⁸, uma abordagem MCR foi proposta para elucidar a informação do componente puro. Usando esta aproximação, três componentes (água, proteínas, e lipídios) foram extraídos de um grande conjunto de dados espectroscópicos confocal Raman in vivo.

A execução de grandes estudos clínicos pode ser exigente em indivíduos que coletam dados espectroscópicos in vivo. Em alguns casos, a aquisição espectral pode exigir o equipamento operando-se por muitas horas em um dia e o estudo pode estender até semanas ou meses. Nessas condições, os dados espectroscópicos podem ser gerados por operadores de equipamentos que não possuem expertise técnica para identificar, excluir e corrigir todas as fontes de artefatos espectroscópicos. O conjunto de dados resultante pode conter uma pequena fração de outliers espectroscópicos que precisam ser identificados e excluídos dos dados antes da análise. Este papel ilustra em detalhe um processo de análise quimiométrico para “limpar” um conjunto de dados clínico Raman antes de analisar os dados com MCR. Para remover com sucesso os outliers, os tipos de outliers e a causa potencial para a geração dos espectros do outlier precisam de ser identificados. Em seguida, uma abordagem específica pode ser desenvolvida para remover os outliers direcionados. Isso requer o conhecimento prévio do conjunto de dados, incluindo um entendimento detalhado sobre o processo de geração e o design do estudo. Neste conjunto de dados, a maioria dos Outliers são baixos espectros de sinal para ruído e originam-se principalmente de 1) espectros recolhidos acima da superfície da pele (6.208 fora de 30.862), e 2) forte contribuição para o espectro da luz fluorescente do quarto (67 de 30.862). Espectros recolhidos acima da superfície da pele produzem uma fraca resposta Raman, como o ponto focal laser se aproxima da superfície da pele e é principalmente na janela do instrumento abaixo da pele. Os espectros com uma contribuição forte da luz fluorescente do quarto são gerados devido ao erro do operador do instrumento ou ao movimento do assunto, que produz uma circunstância onde a janela Confocal da coleção de Raman não seja coberta inteiramente pelo local do corpo do assunto. Embora esses tipos de artefatos espectrais possam ser identificados e remediados durante a aquisição espectral por um especialista espectroscópico no momento da aquisição de dados, os operadores de instrumentos treinados utilizados neste estudo foram instruídos a coletar todos os dados, a menos que um a falha catastrófica foi observada. A tarefa de identificar e excluir outliers é incorporada ao protocolo de análise de dados. O protocolo apresentado é desenvolvido para resolver esse desafio. Para endereçar os baixos espectros do sinal-à-ruído acima da superfície da pele, a posição da superfície da pele precisa de ser determinada primeiramente para permitir a remoção dos espectros recolhidos acima da superfície da pele. A localização da superfície da pele é definida como a profundidade onde o ponto focal do laser Raman é metade na pele e metade da pele, como ilustrado na Figura 1 suplementar. Após a remoção de baixos espectros de sinal para ruído, uma análise de componentes principais (PCA) é implementada para extrair o fator dominado por picos de luz de sala fluorescente. Esses Outliers são removidos com base no valor da Pontuação do fator correspondente.

Este protocolo fornece informações detalhadas sobre como seis componentes principais são determinados no processo MCR. Isso é feito por meio de uma análise de PCA seguida pela comparação da forma espectral entre as cargas para os modelos gerados com um número diferente de componentes principais. O processo experimental para coleta de dados de materiais de referência, bem como os sujeitos humanos também é explicado detalhadamente.