화학 측정 접근을 통해 지층 각막의 생체 내 공초점 라만 스펙트럼에서 물, 단백질 및 지질을 해결
Summary
여기에서, 우리는 스펙트럼 이상치 제거및 주요 특징의 연속적인 추출을 위한 화학측정 접근과 결합된 임상 연구에서 인간 적인 과목에서 공초점 라만 스펙트럼의 수집을 위한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
생체 내 공초점 라만 분광법의 개발은 인간 피험자의 깊이 분해능으로 물, 단백질 및 지질을 직접 측정할 수 있게 합니다. 이 정보는 피부 관련 질병 및 스킨 케어 제품 성능 특성화에 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 화학측정을 활용하는 스펙트럼 데이터 세트의 공초점 라만 스펙트럼 수집 및 후속 분석을 위한 방법을 보여 준다. 이 방법의 목표는 데이터 수집을 위한 표준 프로토콜을 설정하고 데이터 분석을 위한 일반적인 지침을 제공하는 것입니다. 전처리(예: 이상값 스펙트럼 제거)는 임상 연구에서 대용량 데이터 세트를 처리할 때 중요한 단계입니다. 예를 들어 데이터 집합에 대한 사전 지식을 바탕으로 이상값 유형을 식별하고 이를 제거하기 위한 특정 전략을 개발하는 지침을 제공합니다. 주 성분 해석이 수행되고 하중 스펙트럼은 참조 재료의 스펙트럼과 비교하여 최종 다변량 곡선 분해능(MCR) 해석에 사용되는 구성요소 수를 선택합니다. 이 방법은 큰 스펙트럼 데이터 집합에서 의미 있는 정보를 추출하는 데 성공적입니다.
Introduction
임상 연구에서 생체 내 공초점 라만 분광법은 각질층 의 두께와 수분함량을1,2,3,4,및 의 침투를 추적하는 독특한 능력을 보여주었습니다. 활성 물질은 피부에 국소적으로 적용5,6. 비침습적 접근법으로, 공초점 라만 분광법은 진동 모드에 기초하여 분자 신호를 검출합니다. 따라서,라벨링7이필요하지 않습니다. 생체 내 공초점 라만 분광법은 기술의 공초점 특성에 따라 깊이 분해능으로 화학 적 정보를 제공합니다. 이 깊이 의존정보는 피부보호제품4,8,노화9,10,계절변화3, 피부장벽기능질환, 아토피 성 피부염11,12등 . 공초점 라만 분광법 (2,500-4,000cm-1)의고주파 영역에 는 물이 3,250-3,550 cm-1사이의 지역에서 뚜렷한 피크를 생성하는 많은 정보가 있습니다. 그러나, 약 2,800-3,000 cm-1사이에서 중앙에 있는 단백질과 지질의 라만 피크는, 신호가 주로 메틸렌 (-CH2-) 및 메틸 (-CH3) 군13에서 생성되기 때문에 서로 겹칩니다. . 이 중첩된 정보는 개별 분자 종의 상대적인 양을 얻을 때 기술적 인 도전을 제시합니다. 피크 피팅14,15 및 선택적 피크 위치12,16 접근법이 이 문제를 해결하기 위해 사용되었습니다. 그러나, 이러한 단일 피크 기반 방법은 동일한 성분으로부터 다중 라만 피크가 동시에17변화되기때문에 순수한 성분 정보를 추출하기가 어렵다. 최근 간행물18에서,MCR 접근법은 순수한 성분 정보를 해명하기 위하여 제안되었습니다. 이 접근법을 사용하여, 3가지 성분(물, 단백질 및 지질)을 생체 내 의 큰 공초점 라만 분광 데이터 세트로부터 추출하였다.
대규모 임상 연구의 실행은 생체 내 분광 데이터를 수집하는 개인에게 요구 될 수 있습니다. 경우에 따라 스펙트럼 수집은 하루에 여러 시간 동안 운영 장비를 필요로 할 수 있으며 연구는 몇 주 또는 몇 달까지 연장 될 수 있습니다. 이러한 조건하에서 분광 데이터는 분광 아티팩트의 모든 소스를 식별, 제외 및 수정할 수 있는 기술 적 전문 지식이 부족한 장비 운영자에 의해 생성될 수 있습니다. 결과 데이터 세트에는 분석 전에 데이터에서 식별하고 제외해야 하는 분광 이상값의 작은 부분이 포함될 수 있습니다. 이 백서는 MCR로 데이터를 분석하기 전에 임상 라만 데이터 세트를 “정리”하는 화학 분석 프로세스를 자세히 설명합니다. 이상값을 성공적으로 제거하려면 이상값의 유형과 이상값 분광기 생성의 잠재적 원인을 식별해야 합니다. 그런 다음 대상 이상값을 제거하기 위해 특정 접근 방식을 개발할 수 있습니다. 이를 위해서는 데이터 생성 프로세스 및 스터디 설계에 대한 자세한 이해를 포함하여 데이터 집합에 대한 사전 지식이 필요합니다. 이 데이터 집합에서 이상값의 대부분은 신호 대 잡음 스펙트럼이 낮으며 주로 1에서 유래하며 피부 표면 위에 수집된 스펙트럼(30,862개 중 6,208개) 및 2) 형광실 광(30,862개 중 67개)의 스펙트럼에 대한 강력한 기여도를 나타냅니다. 피부 표면 위에 수집 된 스펙트럼은 레이저 초점이 피부 표면에 접근하고 주로 피부 아래의 기기 창에 있기 때문에 약한 라만 반응을 생성합니다. 형광실내 광의 강한 기여도를 가진 스펙트럼은 계기판 작업자 오류 또는 피사체 이동으로 인해 생성되며, 이는 공초점 라만 수집 창이 피사체의 신체 부위에 완전히 가려지지 않는 조건을 생성합니다. 이러한 유형의 스펙트럼 아티팩트는 데이터 수집 당시 분광 전문가가 스펙트럼 수집 중에 식별하고 수정할 수 있지만, 이 연구에 사용된 훈련된 계측기 운영자는 치명적인 실패가 관찰되었습니다. 이상값을 식별하고 제외하는 작업은 데이터 분석 프로토콜에 통합됩니다. 제시된 프로토콜은 이 문제를 해결하기 위해 개발되었습니다. 피부 표면 위의 낮은 신호 대 잡음 스펙트럼을 해결하려면 피부 표면 위에 수집된 스펙트럼을 제거할 수 있도록 먼저 피부 표면의 위치를 결정해야 합니다. 피부 표면의 위치는 보충 도면 1에도시된 바와 같이 라만 레이저 초점이 피부의 절반과 피부의 절반인 깊이로 정의됩니다. 낮은 신호 대 잡음 스펙트럼을 제거한 후, 주요 성분 분석(PCA)이 구현되어 형광실 광피크가 지배하는 계수를 추출합니다. 이러한 이상값은 해당 요인의 점수 값에 따라 제거됩니다.
이 프로토콜은 MCR 프로세스에서 6개의 주요 구성 요소가 어떻게 결정되는지에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 이 작업은 PCA 분석을 통해 수행된 다음 다른 수의 주 구성 요소로 생성된 모델에 대한 하중 간의 스펙트럼 모양 비교를 수행합니다. 인간 피험자뿐만 아니라 참고 자료의 데이터 수집을 위한 실험 과정도 자세히 설명되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜의 섹션 2 및 3에 설명된 바와 같이 데이터 수집 동안, 각 깊이 프로파일은 적색 원에서 강조 표시된 미세한 이미지에서 어두운 영역을 찾아계측기 창과 피부 사이의 접촉이 있는 영역에서 수집되었습니다. 그림 2C. 이러한 영역이 위치되면, 데이터 분석 절차에 대한 피부 표면의 위치를 정확하게 결정하기 위해 피부 표면 위의 깊이 프로파일을 시작하는 …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 기업 기능 분석 및 개인 클렌징 케어 부서의 재정 지원을 크게 인정합니다. 우리는 분석 부이사 인 재스민 왕 (Jasmine Wang)과 롭 가드너 (Robb Gardner) 박사의 지도와 지원에 대해 감사드리며 데이터 수집에 대한 그녀의 도움을 준 리 양 (Li Yang)에게 감사를 표하고 싶습니다.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol 3-sulfate sodium | Sigma-Aldrich | ||
| D-Erythro-Dihydrosphingosine | Sigma-Aldrich | ||
| DI water | Purified with Milipore(18.2MΩ) | ||
| Gen2-SCA skin analyzer | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | Gen2 | |
| Matlab 2018b | Mathwork | 2018b | |
| N-behenoyl-D-erythro-sphingosine | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine(ceramide) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitoleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| PLS_Toolbox version 8.2 | Eigenvector Research Inc. | 8.2 | |
| RiverICon | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | version 3.2 | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | ||
| Stearic Acid | Sigma-Aldrich |
Referencias
- Caspers, P., Lucassen, G., Bruining, H., Puppels, G. Automated depth – scanning confocal Raman microspectrometer for rapid in vivo determination of water concentration profiles in human skin. Journal of Raman Spectroscopy. 31 (8-9), 813-818 (2000).
- Crowther, J., et al. Measuring the effects of topical moisturizers on changes in stratum corneum thickness, water gradients and hydration in vivo. British Journal of Dermatology. 159 (3), 567-577 (2008).
- Egawa, M., Tagami, H. Comparison of the depth profiles of water and water-binding substances in the stratum corneum determined in vivo by Raman spectroscopy between the cheek and volar forearm skin: effects of age, seasonal changes and artificial forced hydration. British Journal of Dermatology. 158 (2), 251-260 (2008).
- Crowther, J. M., Matts, P. J., Kaczvinsky, J. R. . Changes in Stratum Corneum Thickness, Water Gradients and Hydration by Moisturizers. , (2012).
- Pudney, P. D., Mélot, M., Caspers, P. J., Van, D. P. A., Puppels, G. J. An in vivo confocal Raman study of the delivery of trans retinol to the skin. Applied Spectroscopy. 61 (8), 804 (2007).
- Mohammed, D., Matts, P., Hadgraft, J., Lane, M. In vitro-in vivo correlation in skin permeation. Pharmaceutical Research. 31 (2), 394-400 (2014).
- Hanlon, E., et al. Prospects for in vivo Raman spectroscopy. Physics in Medicine and Biology. 45 (2), 1 (2000).
- Mohammed, D., Crowther, J. M., Matts, P. J., Hadgraft, J., Lane, M. E. Influence of niacinamide containing formulations on the molecular and biophysical properties of the stratum corneum. International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 192-201 (2013).
- Boireau-Adamezyk, E., Baillet-Guffroy, A., Stamatas, G. Age-dependent changes in stratum corneum barrier function. Skin Research and Technology. 20 (4), 409-415 (2014).
- Pezzotti, G., et al. Raman spectroscopy of human skin: looking for a quantitative algorithm to reliably estimate human age. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 065008 (2015).
- Mlitz, V., et al. Impact of filaggrin mutations on Raman spectra and biophysical properties of the stratum corneum in mild to moderate atopic dermatitis. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 26 (8), 983-990 (2012).
- Janssens, M., et al. Lipid to protein ratio plays an important role in the skin barrier function in patients with atopic eczema. British Journal of Dermatology. 170 (6), 1248-1255 (2014).
- Faiman, R., Larsson, K. Assignment of the C H stretching vibrational frequencies in the Raman spectra of lipids. Journal of Raman Spectroscopy. 4 (4), 387-394 (1976).
- Edwards, H. G., Farwell, D. W., Williams, A. C., Barry, B. W., Rull, F. Novel spectroscopic deconvolution procedure for complex biological systems: vibrational components in the FT-Raman spectra of ice-man and contemporary skin. Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions. 91 (21), 3883-3887 (1995).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Lipid organization and stratum corneum thickness determined in vivo in human skin analyzing lipid-keratin peak (2820-3030 cm- 1) using confocal Raman microscopy. Journal of Raman Spectroscopy. 47 (11), 1327-1331 (2016).
- Stamatas, G. N., de Sterke, J., Hauser, M., von Stetten, O., van der Pol, A. Lipid uptake and skin occlusion following topical application of oils on adult and infant skin. Journal of Dermatological Science. 50 (2), 135-142 (2008).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Confocal Raman microscopy for investigating the penetration of various oils into the human skin in vivo. Journal of Dermatological Science. , (2015).
- Zhang, L., et al. A MCR approach revealing protein, water and lipid depth profile in atopic dermatitis patients’ stratum corneum via in vivo confocal Raman spectroscopy. Analytical Chemistry. , (2019).
- Caspers, P. J. . In vivo Skin Characterization by Confocal Raman Microspectroscopy. , (2003).
- Jaumot, J., de Juan, A., Tauler, R. MCR-ALS GUI 2.0: New features and applications. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 140, 1-12 (2015).
- Choe, C., Choe, S., Schleusener, J., Lademann, J., Darvin, M. E. Modified normalization method in in vivo stratum corneum analysis using confocal Raman microscopy to compensate nonhomogeneous distribution of keratin. Journal of Raman Spectroscopy. , (2019).
- Wise, B. M., et al. Chemometrics tutorial for PLS_Toolbox and Solo. Eigenvector Research, Inc. 3905, 102-159 (2006).
