Réguas duplas do ADN para estudar o mecanismo da translocação ribosome com a definição do único-nucleotide

O deslocamento Biomolecular é um parâmetro fundamental no estudo do mecanismo das funções biológicas relacionadas. Um exemplo particular é o translocação Ribossome^1,2, durante que o ribossoma se move por exatamente três nucleotídeos (NT) no RNA do mensageiro (mRNA) normalmente, e por um, dois, ou outros números de NT exceto três no caso de ribossômica. Conseqüentemente, uma definição do único-NT do sistema da régua molecular é exigida para distinguir os tamanhos diferentes da etapa. Um desafio maior é sondar o movimento Ribossome nos lados da entrada e da saída. Em outras palavras, somente com um sistema de régua dupla seremos capazes de revelar se o mRNA é suavemente rosqueado através do Ribossome, ou há etapas intermediárias em que os dois lados têm tamanhos de etapa diferentes levando a uma conformação de mRNA tornada ou em loop dentro do Ribossoma.

Vários métodos foram desenvolvidos para abordar o primeiro desafio de resolver diferentes passos no lado de saída do Ribossome (o 3 ‘ fim do mRNA). O ensaio de luciferase dupla resolve os diferentes quadros de leitura medindo as proporções das diferentes proteínas resultantes^3,4. Só é aplicável para o 3 ‘ fim do mRNA e, portanto, insuficiente para fornecer um quadro completo de translocação. A espectrometria de massas pode analisar os diferentes fragmentos de peptídeos como consequência dos rearranjos de código correspondentes⁵. Mas não pode apontar a quantos NT o ribossoma movimentos no mRNA. O teste Toe-Printing é outro método comum que usa uma transcriptase reversa preparada na extremidade 3 ‘-distal para transacir o mRNA em direção ao Ribossome⁶. No entanto, não é aplicável para o 5 ‘ fim do mRNA que está entrando no Ribossome. Outras técnicas, incluindo abordagens de molécula única e métodos de fluorescência⁷, são difíceis de alcançar a resolução de NT único.

Nós desenvolvemos o ensaio duplo da régua do ADN que pode excepcionalmente determinar as posições da entrada e da saída do mRNA descoberto em complexos de ribosome-mRNA.  Os DNAs da régua são oligômeros do ADN que formam duplex de determinados números dos emparelhadas (BP) com o mRNA descoberto pelo ribosome, não obstante que extremidade do mRNA. Os números BP então revelam precisamente a posição Ribossome no mRNA durante a translocação. Os números de BP dos duplex são determinados por suas forças críticas da dissociação obtidas da espectroscopia de magnetização remanescente induzida pela força (firmas)⁸. Com a incerteza da força de 2-3 pN, as forças críticas são suficientes para oferecer a definição do único-NT. Implementando uma molécula do linker nas réguas do ADN, o lado aberta impedido do mRNA pelo Ribossoma pode ser sonhado. Os deslocamentos ribosomal diferentes podem assim ser resolvidos exatamente. Nós revelamos com sucesso um conformação em loop original do mRNA prendido por antibióticos durante o translocação⁹, e os frames de leitura diferentes resolvidos que coexistiram em uma seqüência escorregadia do mRNA¹⁰. Este artigo descreve os detalhes do ensaio duplo da régua, que incluem a preparação dos complexos Ribossoma, a funcionalização de superfície das corrediças de vidro, a imobilização dos complexos Ribossoma e sua hibridação com a régua magneticamente etiquetada do ADN moléculas, detecção magnética e análise do espectro de força por empresas.