Summary

שליטי ה-DNA כפול ללמוד את המנגנון של טרנסלוקציה הריבוכמה עם פתרון יחיד נוקלאוטיד

Published: July 08, 2019
doi:

Summary

שיטת ה-DNA כפול מפותחת כדי לקבוע את מיקום mRNA במהלך הריבוטרנסלוקציה, אשר נשענת על כוחות הדיסוציאציה של דופלקסים DNA-mRNA הנוצר. עם יחיד-נוקלאוטיד החלטה ויכולת להגיע שני הקצוות של mRNA, זה יכול לספק תובנות מכניסטיות עבור טרנסלוקציה ריבוכמה ולחקור אחרים חומצות גרעין displacements.

Abstract

הריבוכמה הטרנסלוקציה מתייחסת לתנועה הריבוזומלית ב-mRNA על-ידי שלושה נוקלאוטידים בדיוק (nt), שהוא השלב המרכזי בסינתזה של חלבונים. כדי לחקור את מנגנון המנגנון, קיימות שתי דרישות טכניות חיוניות. ראשית, רזולוציה בודדת של nt שיכולה לפתור טרנסלוקציה רגילה מ-frameshifting, שבמהלכה הריבוכמה נע על-ידי אחר מ-3 nt. השני הוא היכולת לחקור הן את צדי הכניסה והיציאה של mRNA כדי להבהיר את התמונה כולה של טרנסלוקציה. אנו מדווחים על שיטת ה-DNA הכפולה המבוססת על כוחות הדיסוציאציה הקריטיים של הדופלקסים של DNA-mRNA, המתקבל על ידי שריד מגנטיזציה מגנטית שארית (חברות).  עם 2-4 ברזולוציה הכוח pN, הבחינה הסרגל כפול הוא מספיק כדי להבדיל בין שלבי הטרנסלוקציה שונים. על ידי יישום מקשר ארוך על DNAs בדיקה, הם יכולים להגיע mRNA בצד הנגדי של ריבוכמה, כך מיקום mRNA יכול להיקבע עבור שני הצדדים. לכן, השיטת הסרגל הכפולה מתאימה באופן ייחודי לחקירת הטרנסלוקציה הריבומוגית, ולתנועת חומצת גרעין באופן כללי. אנו מראים תוצאות הנציג אשר הצביעו על mRNA בלולאה היווצרות ונפתר טרנסלוקציה נורמלית מ frameshifting.

Introduction

עקירה ביוקולולקולרית היא פרמטר בסיסי בלימוד המנגנון של הפונקציות הביולוגיות הקשורות. דוגמה אחת היא הריבוכמה טרנסלוקציה1,2, שבמהלכה הריבוכמה נע על ידי שלושה נוקלאוטידים בדיוק (nt) על שליח RNA (mrna) בדרך כלל, ועל ידי אחד, שניים, או מספר אחר של nt מלבד שלושה במקרה של frameshifting. לפיכך, נדרשת רזולוציה יחידה של מערכת שליטה בסרגל מולקולרי כדי להבדיל בין גודלי השלבים השונים. אתגר גדול יותר הוא לחקור את התנועה הריבוחלק הן על הכניסה והן בצד היציאה. במילים אחרות, רק עם מערכת סרגל כפול נוכל לגלות אם mrna הוא משורשר בצורה חלקה דרך ריבוכמה, או יש שלבי ביניים שבו שני הצדדים יש גדלים צעד שונה המוביל לתוך מקוטע או בלולאה mrna היווצרות בפנים ה ריבוזום.

מספר שיטות פותחו כדי להתמודד עם האתגר הראשון של פתרון צעדים שונים בצד היציאה של ריבוחלק (3 ‘ הקצה של mRNA). השיטת לוציפראז כפולה פותרת את מסגרות הקריאה השונות על-ידי מדידת היחס בין החלבונים השונים הנובעים ממנה3,4. היא ישימה רק עבור 3 ‘ סוף mRNA ובכך מספיק כדי לספק תמונה מלאה של טרנסלוקציה. ספקטרומטר מסה יכול לנתח את שברי הפפטיד השונים כתוצאה מסידור הקוד המקביל5. אבל זה לא יכול להצביע על כמה nt הריבוכמה נע על mRNA. שיטת ההדפסה הבוהן היא שיטה נפוצה נוספת המשתמשת בטרנסקריפטאז הפוכה שהייתה מועלת ב -3 ‘-הסוף כדי לתעתור את ה-mRNA לקראת הריבוחלק6. עם זאת, היא אינה ישימה עבור 5 ‘ סוף mRNA כי הוא להזין את ריבוכמה. טכניקות אחרות, כולל גישות מולקולה יחידה ושיטות זריחה7, קשה להשיג רזולוציה בודדת-nt.

פיתחנו את שיטת ה-DNA כפול שניתן לקבוע באופן ייחודי הן את מיקומי הכניסה והיציאה של mRNA החשופה ב-מכלולי הריבוכמה-mRNA.  DNAs הסרגל הם ה-DNA oligomers שיוצרים דופלקסים של מספר מסוים של זוגות בסיס (bp) עם mRNA חשף על ידי הריבוכמה, ללא קשר לאיזה קצה של mRNA. מספרי bp ולאחר מכן בדיוק לחשוף את מיקום הריבוכמה על mRNA במהלך הטרנסלוקציה. מספרי הלחץ של הדופלקסים נקבעים על ידי כוחות הדיסוציאציה הקריטיים שלהם, שהתקבלו מהספקטרוסקופיית מגנטיזציה (חברות)8. עם 2-3 בחוסר ודאות כוח, הכוחות הקריטיים מספיקים כדי להציע רזולוציה בודדת nt. על-ידי יישום מולקולת מקשר על שליטי ה-DNA, הצד הפריע באופן שחור של mRNA על ידי הריבוכמה ניתן לנחקר. הריבוזומdisplacements שונים יכולים ובכך להיפתר במדויק. הצלחנו לחשוף בהצלחה היווצרות בלולאה ייחודית של mRNA לכוד על ידי אנטיביוטיקה במהלך הטרנסלוקציה9, ופתרו מסגרות קריאה שונות שנוצרו ברצף mrna חלקלק10. מאמר זה מתאר את הפרטים של מערך הסרגל הכפול, הכולל הכנת מכלולי ריבוכמה, הפונקציונליות של פני השטח של שקופיות הזכוכית, השתק של מכלולי ריבוכמה והכלאה שלהם עם השליט DNA מגנטית מתויג מולקולות, זיהוי מגנטי וניתוח ספקטרום הכוח של חברות משרדי.

Protocol

1. הכנת הריבוכמה מתחמי להפוך 1,000 mL של TAM10 מאגר, אשר מורכב 20 מ”מ-HCl (pH 7.5), 10 מ”מ Mg (OAc)2, 30 מ”מ NH4Cl, 70 mm KCL, 5 מ”מ EDTA, 7 מ”מ bme (2-mercaptoethanol), ו 0.05% Tween20. הכינו את חמשת התערובות שמופיעות בטבלה 1.הערה: הריבוחלק היה מהזן MRE60011. EF-Tu: גורם התארכות בלתי יציב. EF-Ts: גורם התארכות…

Representative Results

איור 1 מציג את ערכת האיתור והתצלומים של הרכיבים המרכזיים. זיהוי מגנטי מושגת על ידי מגנטומטר אטומי באמצעות ערכת הסריקה (איור 1א)13. המדגם ממוקם על מוט רכוב על מנוע ליניארי. המנוע מסיע את הדגימה לחיישן האטומי בתוך מגן מגנטי, ואז בחזרה לאתר ?…

Discussion

בתוך השליטה הכפולה שלנו, החרוזים המגנטיים לשחק שני תפקידים חיוניים. ראשית, הם משמשים ככוח התמרה כי הכוח הצנטריפוגלי הוא יחסי למסה הפרוע שלהם. שנית, החרוזים הם נושאות איתותים שזוהו על ידי מגנטומטר אטומי, שכרגע הוא החיישן המגנטי המדויק ביותר. שילוב מניפולציה מכנית וזיהוי מגנטי, שיטת המשרדים …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי האמריקאי לבריאות (R01GM111452, י, S.X.). י. ו. מאשר תמיכה מקרן וולש (E-1721).

Materials

Styrene Strip City of Industry MS-861
Glass slides Evaporated Coatings 60.0 × 4.0 × 0.3 mm3
Acetic acid Millipore Sigma A6283-500ML
3-Aminopropyltriethoxysilane UCT specialties 21400088
mPEG-SVA Laysan Bio 154-82
Biotin-PEG-SVA Laysan Bio 152-84
Sodium bicarbonate Millipore Sigma S5761-500G
Epoxy glue Devcon 31345
Streptavidin ThermoFisher 434301
Fusidic Acid Millipore Sigma F0756-1G
Neomycin Sulfate Millipore Sigma 1458009
Viomycin Sulfate Millipore Sigma 1715000
Hygromycin invitrogen 10687-010
Tris-HCl Millipore Sigma T5941-100G
Magnesium acetate Millipore Sigma M5661-50G
Ammonium chloride Millipore Sigma A9434-500G
Potassium chloride Millipore Sigma P9333-500G
EDTA GIBCO 774750
2-mercaptoethanol Millipore Sigma M6250-500ML
Tween20 Millipore Sigma P1379-250ML
GTP Millipore Sigma G8877-100MG
PEP Millipore Sigma P7127-100MG
Pyruvate Kinase Millipore Sigma P1506-5KU
Sucrose  Millipore Sigma S7903-5KG
Dynabeads M-280 Streptavidin ThermoFisher 11205D
mRNA Oligo Integrated DNA Technologies 133899727 5′-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3′ 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 157468630 3ʹ- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5ʹ 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 164845370 3ʹ-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5’ 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 157468628 3ʹ-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5’ 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 163472705 3ʹ-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5’ 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 138678130 3ʹ-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 138678131 3ʹ-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 138678132 3ʹ-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5ʹ 
DNA Oligo Integrated DNA Technologies 138678133 3ʹ-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5’ 
Centrifuge Eppendorf 5427R
Micro Ultracentrifuge Hitachi CS150FNX
Vortex mixer VWR VM-3000
Lock-in Amplifier Stanford Research Systems SR530
Lock-in Amplifier Stanford Research Systems SR830
Laser Newport TLB-6918-D
Function generator Stanford Research Systems DS345
Photo detectors Thorlabs DET36A

Referencias

  1. Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA. Quarterly Review of Biophysics. 50, 12 (2017).
  2. Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation. Science. 345, 1188-1191 (2014).
  3. Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA. 4, 479-486 (1998).
  4. Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).
  5. Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160, 870-881 (2015).
  6. Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Research. 38, 15 (2010).
  7. Chen, J., et al. Dynamic pathways of -1 translational frameshifting. Nature. 512, 328-332 (2014).
  8. De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA. Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).
  9. Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers reveal an “mRNA looping” intermediate state during ribosome translocation. RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).
  10. Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. High-efficiency “-1” and “-2” ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).
  11. Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).
  12. Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance. Optics Letters. 35, 661-663 (2010).
  13. Yao, L., Xu, S. Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).
  14. Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics. Physical Biology. 5, 046005 (2008).
  15. Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
  16. Jacks, T., et al. Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression. Nature. 331, 280-283 (1988).
  17. Schuwirth, B. S., et al. Structures of the bacterial ribosome at 3.5 Å resolution. Science. 310, 827-834 (2005).
  18. Jia, H., Wang, Y., Xu, S. Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps. Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).

Play Video

Citar este artículo
Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution. J. Vis. Exp. (149), e59918, doi:10.3791/59918 (2019).

View Video