격자 광 시트 현미경을 사용하여 표면 T 세포 수용체 역학 4 차원 시각화
Summary
이 프로토콜의 목표는 살아있는 세포에 있는 표면 수용체 역학을 4 차원으로 가시화하기 위하여 격자 빛 시트 현미경 검사를 사용하는 방법을 보여주기 위한 것입니다. 여기서CD4+ 원발성 T 세포상에 T 세포 수용체가 도시된다.
Abstract
세포의 신호 및 기능은 표면 수용체의 동적 구조와 상호 작용에 의해 결정됩니다. 진정으로 이 수용체의 구조 기능 관계를 이해하기 위하여는, 우리는 충분한 주분체 해결책을 가진 살아있는 세포 표면에 그(것)들을 구상하고 추적할 필요가 있습니다. 여기에서 우리는 살아있는 세포막에 있는 T 세포 수용체 (TCRs) 4 차원 (4D, 공간 및 시간)를 심상하기 위하여 최근에 개발한 격자 빛 시트 현미경 검사법 (LLSM)를 사용하는 방법을 보여줍니다. T 세포는 적응형 면역 계통의 주요 이펙터 세포 중 하나이며, 여기서 우리는 이러한 세포의 신호및 기능이 TCRs의 역학 및 상호작용에 의해 구동된다는 것을 보여주기 위해 T 세포를 예로사용하였다. LLSM은 전례 없는 시공간 해상도로 4D 이미징을 가능하게 합니다. 이 현미경 기술은 그러므로 생물학에 있는 다른 세포의 표면 또는 세포내 분자의 넓은 배열에 일반적으로 적용될 수 있습니다.
Introduction
3차원 세포 표면에서 실시간으로 트래피킹하고 확산되는 분자의 정확한 역학은 해결해야 할 수수께끼였습니다. 현미경 검사법은 항상 속도, 감도 및 해상도의 균형이었습니다. 하나 또는 두 개가 최대화되면 세 번째가 최소화됩니다. 따라서 표면 수용체가 이동하는 작은 크기와 엄청난 속도로 인해 역학을 추적하는 것은 세포 생물학 분야의 주요 기술적 과제로 남아 있습니다. 예를 들어, 많은 연구는 전체 내부 반사 형광을 사용하여 실시되었습니다 (TIRF) 현미경 검사법1,2,3,이는 높은 측두력을 가지고 있지만, T 세포 막의 매우 얇은 조각을 이미지 할 수 있습니다 (~ 100 nm), 따라서 세포에서 멀리 일어나는 이벤트를 놓친다. 이러한 TIRF 이미지는 또한 세포의 2차원 섹션만을 보여준다. 이와 대조적으로, 경질 광학 재건 현미경 검사법(STORM)4,광활성화 국소화 현미경(PALM)5및 자극방출 고갈 현미경(STED)6,빛의 절제 한계를 극복할 수 있는 초고해상도 기술. 이러한 기술은 높은 공간 해상도 (~ 20 nm 해상도)4,5,6,7,그러나 그들은 종종 전체 2 차원 (2D) 또는 3 차원 (3D) 이미지를 취득하는 데 많은 시간이 소요되므로 시간 해상도가 손실됩니다. 또한 깜박이는 신호에 의존하는 STORM 및 PALM과 같은 기술은8,9를계산하는 데 부정확할 수 있습니다. 전자 현미경 검사법은 지금까지 가장 높은 해상도 (최대 50 오후 해상도)10; 그것은 심지어 최대 3 nm XY 및 500 nm Z 해상도11의결과로 집중 된 이온 빔 스캐닝 전자 현미경 검사법 (FIB-SEM)으로 3 차원으로 수행 될 수 있습니다. 그러나, 전자 현미경 검사법의 어떤 양식든지 가혹한 견본 준비를 요구하고 고정형 세포 또는 조직으로만, 시간이 지남에 따라 화상 진찰 살아있는 견본의 가능성을 제거하.
그들의 진정한 생리학적 3D 성질에서 살아있는 세포에서 표면 및 세포내 분자의 역학을 식별하는 데 필요한 높은 시공간적 분해능을 얻는 기술은 최근에 개발되고 있다. 이러한 기술 중 하나는 격자 빛 시트 현미경 검사법 (LLSM)12,이는 크게 광 표백을 낮추기 위해 구조화 된 빛 시트를 활용. 2014년 노벨상 수상자 에릭 베치그(Eric Betzig)가 개발한 높은 축 해상도, 낮은 광표백 및 배경 잡음, 그리고 시야당 수백 개의 평면을 동시에 이미지화할 수 있는 능력은 LLS 현미경을 광시야, TIRF 및 공초점 현미경12,13,14,15,16,18,18, 19보다우수하게 만듭니다. 이 4차원(x, y, z 및 시간) 이미징 기술은 여전히 회절 제한(~200 nm XYZ 해상도)을 유지하면서 놀라운 시간 해상도(약 100fps의 프레임 속도를 달성하여 프레임당 0.85초로 3D 재구성셀 이미지를 생성함)를 가지고 있습니다.
LLSM은 일반적으로 단일 분자 및 단일 세포 수준에서 임의의 세포 내의 임의의 분자의 실시간 역학을 추적하는 데 사용될 수 있으며, 특히 면역 세포와 같은 매우 운동성 세포에서 그. 예를 들어, 우리는 T 세포 수용체 (TCR) 역학을 시각화하기 위해 LLSM을 사용하는 방법을 여기에 보여줍니다. T 세포는 적응형 면역 계통의 이펙터 세포이다. TRS는 T 세포의 선택, 발달, 분화, 운명 및 기능을 결정하는 항원 제시 세포(APC)의 표면에 표시되는 펩티드-MHC(pMHC) 리간드를 인식하는 책임이 있다. 이 인식은 T 세포와 APC 사이의 인터페이스에서 발생, 면역 시냅스라고 불리는 것을 형성하기 위해 국지적 인 수용체 클러스터링의 결과. 면역 학적 시냅스에서 TCR이 T 세포 이펙터 기능에 필수적이라고 알려져 있지만, 아직 알려지지 않은 시냅스로 실시간 TCR 인신 매매의 기본 메커니즘은 알 수 없습니다. LLSM은 결과 pMHC-TCR 상호 작용으로 시냅스로 인신 매매 전후의 TCR의 역학을 실시간으로 시각화할 수 있게 해 주었으며(그림1). 따라서 LLSM은 TCRs의 조형 역학에 대한 현재의 질문을 해결하고 세포가 자기 항원과 외국 항원을 구별하는 방법을 이해하는 통찰력을 제공하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제시된 프로토콜은 5C로부터 단리된CD4+ T 세포의 사용을 위해 최적화되었다. LLSM 계측기상 C7 형질전환 마우스가 사용되고, 따라서 다른 세포 시스템 및 LLSM은 다르게 최적화되어야 할 수도 있다. 그러나, 이 프로토콜은 생리적 조건에서 최소한의 왜곡으로 전체 세포에 표면 수용체의 역학을 정량화하는 데 사용될 수 있기 때문에 4D 이미징의 힘을 보여줍니다. 따라서 이 기술의 향후 응용 프…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 시카고 대학의 비타스 빈도카 박사의 조언과 지도를 인정하고 싶습니다. 우리는 격자 광 시트 현미경을 지원하고 유지에 대한 시카고 대학의 통합 빛 현미경 코어 시설에 감사드립니다. 이 작품은 NIH 뉴 이노베이터 어워드 1DP2AI14245 및 NSF 커리어 어워드 1653782(J.H.)에 의해 지원되었습니다. J.R.은 NSF 대학원 연구 펠로우십 프로그램에 의해 지원됩니다.
Materials
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | For T cell harvest |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-25ML | For T cell culture |
| 5 mm round coverslips | World Precision Instruments | 502040 | For Imaging |
| 70um Sterile Cell Strainer | Corning | 7201431 | For T cell harvest |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse TCR β chain Antibody | BioLegend | 109215 | For Imaging |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | X&Y Cell Culture | FBS-500 | For T cell culture |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | Denisty gradient reagent for T cell harvest |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | For microscope alignment |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres | Thermo Fisher Scientific | F8810 | For microscope alignment |
| Imaris | Bitplane | N/A | Tracking Software; Other options for tracking software include Amira or Trackmate (Fiji). |
| Lattice Light-Sheet Microscope | 3i | N/A | Microscope Used |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 21083027 | For Imaging |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | For T cell culture |
| LLSpy | Janelia Research Campus | N/A | LLSpy was used under license from Howard Hughes Medical Institute, Janelia Research Campus. Contact innovation@janelia.hhmi.org for access. Other deconvolution and deksewing methods are available in image processing softwares such as Fiji, Slidebook, Amira, and others. https://llspy.readthedocs.io/en/latest/ |
| Moth Cytochrome C (MCC), sequence ANERADLIAYLKQATK | Elimbio | Custom Synthesis | For T cell harvest |
| Penacillin/Streptamycin | Life Technologies | 15140122_3683884612 | For T cell culture |
| Poly-L-Lysine | Phenix Research Products | P8920-100ML | For Imaging |
| RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4300-54 | For T cell harvest |
| Recombinant mouse IL-2 | Sigma-Aldrich | I0523 | For T cell culture |
| RPMI 1640 Medium | Corning | MT10040CV | For T cell culture |
| Slidebook | 3i | N/A | LLSM imaging software |
| Surgical Dissection Tools | Nova-Tech International | DSET10 | For T cell harvest |
| T-25 Flasks | Eppendorf | 2231710126 | For T cell culture |
| Thermo Scientific Pierce Fab Micro Preparation Kits | Thermo Fisher Scientific | 44685 | For preparing Fab |
Referencias
- Poulter, N. S., Pitkeathly, W. T. E., Smith, P. J., Rappoport, J. Z. The Physical Basis of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy and Its Cellular Applications. Methods in Molecular Biology. 1251, 1-23 (2015).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123, 3621-3628 (2010).
- Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
- Shroff, H., White, H., Betzig, E. Photoactivated Localization Microscopy (PALM) of Adhesion Complexes. Current Protocols in Cell Biology. 58 (1), 1-28 (2013).
- Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level. Molecular Cell. 58 (4), 644-659 (2015).
- Ji, N., Shroff, H., Zhong, H., Betzig, E. Advances in the speed and resolution of light microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 18 (6), 605-616 (2008).
- . Atomic Resolution Imaging with a sub-50 pm Electron Probe Available from: https://escholarship.org/uc/item/3cs0m4vr (2019)
- Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. Journal of Microscopy. 254 (3), 109-114 (2014).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. , (2014).
- Ni, J., et al. Adoptively transferred natural killer cells maintain long-term antitumor activity by epigenetic imprinting and CD4+ T cell help. Oncoimmunology. 5 (9), 1219009 (2016).
- Chaudhri, A., Xiao, Y., Klee, A. N., Wang, X., Zhu, B., Freeman, G. J. PD-L1 Binds to B7-1 Only In Cis on the Same Cell Surface. Cancer Immunology Research. 6 (8), 921-929 (2018).
- Forbes, C. A., Scalzo, A. A., Degli-Esposti, M. A., Coudert, J. D. Ly49C-dependent control of MCMV Infection by NK cells is cis-regulated by MHC Class I molecules. PLoS pathogens. 10 (5), 1004161 (2014).
- Schöneberg, J., et al. 4D cell biology: big data image analytics and lattice light-sheet imaging reveal dynamics of clathrin-mediated endocytosis in stem cell-derived intestinal organoids. Molecular biology of the cell. 29 (24), 2959-2968 (2018).
- Gao, R., et al. Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution. Science. 363 (6424), 8302 (2019).
- Cai, E., et al. Visualizing dynamic microvillar search and stabilization during ligand detection by T cells. Science. 356 (6338), 3118 (2017).
- Ritter, A. T., et al. Actin Depletion Initiates Events Leading to Granule Secretion at the Immunological Synapse. Immunity. , (2015).
- Lim, J. F., Berger, H., Su, I. -. H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (116), e54596 (2016).
- Huang, J., et al. A Single Peptide-Major Histocompatibility Complex Ligand Triggers Digital Cytokine Secretion in CD4+ T Cells. Immunity. 39 (5), 846-857 (2013).
- Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419 (6909), 845-849 (2002).
- Jansson, A. A mathematical framework for analyzing T cell receptor scanning of peptides. Biophysical journal. 99 (9), 2717-2725 (2010).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
