수생 생태계에서 유기 탄소 흐름의 새로운 경로를 밝히기 위해 추적자로 형광으로 분류 된 박테리아
Summary
여기에 제시된 것은 높은 정밀도와 분류학적 분해능으로 수생 약탈 진핵생물의 방목 속도를 정량화하는 단일 세포, epifluorescence 현미경 기반 기술에 대한 프로토콜입니다.
Abstract
포식과 그 효과와 같은 영양 상호 작용을 해명하는 것은 생태학에 있는 많은 연구원을 위한 빈번한 작업입니다. 미생물 공동체의 연구는 많은 한계를 가지고 있으며, 육식 동물, 먹이 및 약탈 비율을 결정하는 것은 종종 어렵습니다. 여기에 제시된 것은 형광으로 표지된 먹이를 트레이서로 추가하여 수생 육식 진핵생물의 방목 속도의 안정적인 정량화와 더 높은 영양 수준으로의 영양 전달 추정을 가능하게 하는 최적화된 방법입니다.
Introduction
이종 영양 성 원생 체는 수생 시스템의 주요 생물학적 구성 요소이며 플랑크톤 바이오 매스1,2,3의상당한 부분을 차지합니다. 그들의 풍부, 다양성 및 활동을 통제하는 요인은 생물 지구 화학 사이클링에 있는 그들의 역할을 이해하는 위해 중요합니다 (즉, 유기 탄소 및 그밖 양분의 운명 및 원핵생물에서 더 높은 영양 수준에 에너지의 교류). 원생 동물 방목은 이러한 중요한 요소 중 하나입니다. 이종 영양 나노 깃 형성 및 섬모의 박취는 원핵 생물 풍부, 지역 사회 기능, 구조, 다양성, 심지어 세포 형태와 특정 세균 그룹의 성장 속도에 대한 강력한 하향식 제어를 부과4, 5,6. 일부 시스템에서는, protists세균 사망의 주요 원인으로 봉사6,7.
지금 얼마 동안 이용된 원생 동물 세균을 평가하기 위하여 이용된 표준 접근은, 먹이 유사체 및 epifluorescence 현미경 검사법으로 형광으로 표지된 박테리아 (FLB)의 사용을 관련시킵니다. 세포 특이적 관세포 비율은 선택된 시간 과정8에걸쳐 프로티스탄 식품 액구에서 표지된 먹이 입자의 수를 정량화함으로써 결정될 수 있다. 이 접근 방식에는 몇 가지 장점이 있습니다. 트레이서자연 육식 동물과 먹이 조립과 자연 샘플에 추가됩니다. 인큐베이션 전에 최소 샘플 조작, 추가된 FLB 추적에 의한 최소 샘플 변경, 인큐베이션 시간이 짧아 상태 조건에서 가까운 조건에서 얻은 음량 결과를 보장합니다. 또는, 세균성 프로티스트 또는 동물플랑크톤(예: 해양 해양 시스템)이 적은 환경에서는 소량(2%-3% 추적자)으로 시료에 첨가된 FLB의 소실률이 장기간 유세포측정을 통해 검출할 수 있습니다(12-24시간). 인큐베이션 실험. 그런 다음 시작 점과 끝점의 FLB 수(모든 세균의 영향을 통합)는 유세포 측정에 의해 정량화됩니다(자세한 내용은 이전 간행물9참조). 그러나, 이러한 파라미터는 특정 프로티스탄 및 동물플랑크톤 방목기 그룹 또는 종에 직접적으로 기인할 수 없는 총 집계 된 세균 비율을 나타냅니다.
전반적으로, 수생 환경에서 프로티스탄 종- 또는 형태형 특이적 세균 사망률을 정확하고 생태학적 의미로 정량화하는 것은 어려울 수 있다. 일부 프로티스트는 선택적 방목자이며, 추가된 FLB 트레이서의 크기 및 세포 형상은 먹이 섭취의 자연적인 비율을 왜곡할 수 있다10,11. 더욱이, 프로티스탄 활동 및 물질 대사는 매우 온도에 민감한12; 따라서 추가된 FLB 추적자의 양은 각 개별 샘플 유형에 대해 신중하게 조작되어야 합니다(박테리아의 자연적인 풍부성, 크기 및 형태와 세균의 일반적인 유형뿐만 아니라 온도에도 따라). 대부분의 연구는 대량 프로 티 스탄 방목 활동에 초점; 그러나, 특정 프로티스탄 종의 세균은 종종 훨씬 더 높은 정보 값을 보유하고 바람직 할 수있다. 이 경우 샘플에 존재하는 프로티스트 종에 대한 분류학적 지식과 행동에 대한 이해가 필요합니다. 따라서, 시간과 노동의 상당한 금액은 특정 프로티스탄 그룹 또는 종에 기인 하는 세균의 종 특정 비율에 대 한 사운드 결과 얻을 필요.
이러한 어려움에도 불구하고,이 방법은 자연 설정에서 프로티스탄 세균을 평가하기 위해 현재 사용할 수있는 가장 적합한 도구 남아있다. 여기에 제시된 수생 미생물 생태 학 연구에서 FLB를 추적자로 사용하기위한 포괄적이고 따르기 쉬운 방법입니다. 접근법의 모든 문제적 측면을 설명하고 개선 된 워크플로우를 설명하며, 대조적인 환경에서 두 가지 실험과 함께 섬모 종을 대조적으로 예로 설명합니다.
첫 번째 사례 연구는 체코의 중불위성 의 르지모프(Římov) 저수지에서 에필림네틱 환경에서 수행되었으며, 이는 대부분의 수면담수 체에 필적하는 방목지와 세균풍부를 보여줍니다(5,7참조). 두 번째 사례 연구는 수생 육식 식물 Utricularia 반사의트랩 내부 매우 특정 환경에서 실시되었다, 이는 모두 방목 mixotrophic 섬모의 매우 높은 숫자를 호스팅(테트라 히메나 utriculariae) 및 세균 성 세포. 두 샘플 유형 모두에서 세포 별 방목 속도 및 세균 서 주식의 계산이 표시됩니다. 결과의 생태 해석의 범위는 그 때 토론되고, 가능한 후속 연구 결과의 보기는 마침내 건의됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
수생 시스템에서 영양 상호 작용을 해독하는 것은 항상 도전28,특히 protists와 그들의 먹이, 박테리아를 포함하는 나노 플랑크톤 규모에서. 영양 섭취 경로 및 정량화에 관해서, 성공적으로 높은 영양 수준에서 사용 하는 방법의 응용 프로그램은 덜 가능, 생물 학적 상호 작용의 높은 복잡성으로 인해. 여기에는 예를 들어 안정적인 동위원소 라벨링 접근법이 포함됩니다. 이 프로토…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 연구 보조금 13-00243S및 K. Š. 및 D. S.에게 각각 수여된 19-16554S의 밑에 체코 과학 재단에 의해 지원되었습니다. 이 기사는 또한 “댐 저수지의 수질 개선을위한 도구로 바이오 조작”(없음 CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_025/0007417), 운영 프로그램 연구, 개발에 유럽 지역 개발 기금에 의해 지원되었다 교육.
Materials
| 0.2-µm pore-size filters | SPI supplies, https://www.2spi.com/ | B0225-MB | Black, polycarbonate track etch membrane filters, diameter approprite for filtering apparatus used |
| 5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl) aminofluorescein (DTAF) | Any brand | ||
| Automatic pipettes with adjustable volumes | Any brand, various sizes | ||
| Centrifuge | 22 000 x g | ||
| Cryovials | Any brand, 2 mL size | ||
| DAPI (4´,6-Diamidino-2´-phenylindole dihydrochloride) | Any brand | 1 mg ml-1 | |
| Epiflorescence microscope | Magnification from 400 x up to 1000 x | ||
| Filters appropriate for viewing in the DAPI and DTAF range | |||
| Counting grid in one of the oculars | |||
| Filtering apparatus | Usually with a diameter of 25 mm | ||
| Formaldehyde | A brand for microscopy | ||
| Glutaraldehyde | A brand for microscopy | ||
| Immersion oil for microscopy | Specific oil with low fluorescence | ||
| Lugol´s solution | Any brand or see comment | Make an alkaline Lugol' solution as follows: Solution 1 – dissolve 10 g of potassium iodide in 20 ml in MQ water, then add 5 g of iodine. Solution 2 – add 5 g of sodium acetate to 50 ml of MQ water. Add the solution 2 to the solution 1 and thoroughly mix | |
| Methanol stabilized formalin | Any brand available for microscopy purposes | ||
| Microscope slides and cover slips | Any brand produced for microscopy purposes | ||
| MQ water for diluting samples | Any brand |
||
| Phosphate-buffered saline (PBS; pH = 9) | Any brand | 0.05 M Na2HPO4-NaCl solution, adjusted to pH 9 | |
| PPi-saline buffer | Any brand | 0.02 M Na4P2O7-NaCl solution. Add 0.53 g Na4P2O7 to 100 ml of MQ water plus 0.85 g NaCl | |
| Sampling device | Appropriate for obtaining representative sample | e.g. Friedinger sampler for lake plankton | |
| Sodium thiosulfate solution | Any brand | 3% solution is used in the protocol | |
| Sonicator | Any brand | 30 W | |
| Vortex | Any brand allowing thorough mixing of the solutes and samples | ||
| Water bath | Any brand allowing temperature to be maintained at 60 °C |
Referencias
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