Enzymatische synthese van Epoxidized metabolieten van docosahexaeenzuur, Eicosapentaeenzuur en arachidonzuur zuren
Summary
Wij presenteren een methode nuttig voor grootschalige enzymatische synthese en zuivering van specifieke enantiomeren en regioisomers van epoxiden van arachidonzuur zuur (AA), docosahexaeenzuur zuur (DHA), en Eicosapentaeenzuur zuur (EPA) met het gebruik van een bacteriële cytochroom P450 enzym (BM3).
Abstract
De epoxidized metabolieten van verschillende meervoudig onverzadigde vetzuren (Pufa’s), genoemd epoxy vetzuren, hebben een breed scala van rollen in de menselijke fysiologie. Deze metabolieten worden endogene geproduceerd door de cytochroom P450 klasse van enzymen. Vanwege hun uiteenlopende en krachtige biologische effecten, is er veel belang bij het bestuderen van deze metabolieten. Het bepalen van de unieke rollen van deze metabolieten in het lichaam is een moeilijke taak, aangezien de epoxy vetzuren eerst in significante hoeveelheden en met hoge zuiverheid moeten worden verkregen. Het verkrijgen van verbindingen uit natuurlijke bronnen is vaak arbeidsintensief, en oplosbare epoxide hydrolasen (sEH) snel hydroliseer de metabolieten. Aan de andere kant, het verkrijgen van deze metabolieten via chemische reacties is zeer inefficiënt, als gevolg van de moeilijkheid van het verkrijgen van pure regioisomers en enantiomeren, lage opbrengsten, en uitgebreide (en dure) zuivering. Hier presenteren we een efficiënte enzymatische synthese van 19 (s), 20 (r)-en 16 (s), 17 (r)-epoxydocosapentaenoic zuren (toezichthouder) van DHA via epoxidatie met BM3, een bacteriële CYP450 enzym geïsoleerd oorspronkelijk uit Bacillus megaterium (dat is gemakkelijk uitgedrukt in Escherichia coli). Karakterisering en bepaling van de zuiverheid wordt uitgevoerd met nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (NMR), high-performance vloeistofchromatografie (HPLC), en massaspectrometrie (MS). Deze procedure illustreert de voordelen van enzymatische synthese van PUFA epoxy metabolieten, en is van toepassing op de epoxidatie van andere vetzuren, met inbegrip van arachidonzuur zuur (AA) en Eicosapentaeenzuur acid (EPA) voor de productie van de analoge epoxyeicosatrienoic zuren (Eet’s) en epoxyeicosatetraenoic zuren (EEQs), respectievelijk.
Introduction
Als belangstelling voor de rol die meervoudig onverzadigde vetzuren (met name omega-3 en omega-6 meervoudig onverzadigde vetzuren) spelen in de menselijke biologie is gegroeid in de afgelopen jaren, hebben onderzoekers kennis genomen van het brede scala van aantrekkelijke voordelen die hun metabolieten Vertonen. In het bijzonder, epoxy vetzuur metabolieten geproduceerd door de cytochroom P450 klasse van enzymen zijn een groot punt van focus. Bijvoorbeeld, spelen vele PUFA epoxiden, met inbegrip van epoxyeicosatrienoic zuren (eet’s), epoxydocosapentaenoic zuren (toezichthouder) en epoxyeicosatetraenoic zuren (EEQs), een kritieke rol in regelgeving van bloeddruk en ontsteking1,2 , 3 , 4 , 5. interessant is dat de specifieke enantiomeren en regioisomers van AA en EPA epoxiden is bekend dat verschillende effecten hebben op vasoconstrictie6,7. Terwijl de fysiologische effecten van de enantiomeren en regioisomers van Eet’s en EEQs zijn gedocumenteerd, is er weinig bekend over het effect van de analoge epoxydocosapentaenoic zuren (toezichthouder) gevormd uit DHA. Wijdverbreid gebruik van visolie8, die rijk is aan zowel EPA en DHA, heeft ook geroerd belangstelling voor de toezichthouder9. De voordelen van deze supplementen zijn vermoedelijk deels te wijten aan de downstream-DHA metabolieten (16, 17-EDP en 19, 20-EDP is de meest voorkomende), omdat in vivo niveaus van de toezichthouder coördineren zeer goed met de hoeveelheid DHA in de voeding10, 11.
Het bestuderen van de mechanismen en doelstellingen van deze epoxy vetzuren door metabolomics, chemische biologie, en andere methoden heeft bewezen uitdagend, deels omdat ze bestaan als mengsels van regio-en stereo-isomeren, en een methode voor het verkrijgen van zuivere hoeveelheden van de enantiomeren en regioisomers is vereist. Conventionele middelen voor het chemisch synthetiseren van deze verbindingen zijn ondoeltreffend gebleken. Het gebruik van peroxyzuren zoals META-Chloorperoxybenzoëzuur zuur voor epoxidatie heeft vele nadelen, in het bijzonder het gebrek aan epoxidatie selectiviteit, die dure en nauwgezette reiniging van individuele regioisomers en enantiomeren noodzakelijk maakt. Totale synthese van DHA en EPA metabolieten is mogelijk, maar ook lijdt aan nadelen die het onpraktisch maken voor grootschalige synthese, zoals hoge kosten en lage opbrengsten12,13. De efficiënte algemene productie kan met enzymatische synthese worden bereikt, aangezien de enzymatische reacties regio-en Stereoselectieve14zijn. Studies tonen aan dat enzymatische epoxidatie van AA en EPA (met BM3) is zowel regioselective en enantioselectieve15,16,17,18, maar deze procedure is niet getest met DHA, of op een grote Schaal. Het algemene doel van onze methode was om deze chemoenzymatic epoxidatie te schalen en te optimaliseren om snel significante hoeveelheden zuivere epoxy vetzuren als hun individuele enantiomeren te produceren. Met behulp van de hier gepresenteerde methode, onderzoekers hebben toegang tot een eenvoudige en kosteneffectieve strategie voor de synthese van de toezichthouder en andere PUFA epoxy metabolieten.
Protocol
Representative Results
Discussion
We presenteren hier een operationeel eenvoudige en kosteneffectieve methode voor de voorbereiding van de twee meest voorkomende epoxy metabolieten van DHA-19, 20 en 16, 17-EDP. Deze epoxy vetzuren kunnen worden bereid in zeer enantiopure (als hun S, R-isomeren) vorm met behulp van wild-type BM3 enzym. Hieronder vindt u een aantal kritieke punten die kunnen worden gebruikt voor het oplossen van problemen, en de uitbreiding van onze methode tot de voorbereiding van enantiopure epoxy metabolieten van AA en EPA.
…Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt gefinancierd door R00 ES024806 (nationale instituten van gezondheid), DMS-1761320 (de nationale stichting van de wetenschap) en de fondsen van het opstarten van de Universiteit van de staat van Michigan. De auteurs willen Dr. jun Yang (Universiteit van Californië bij Davis) en Leonora Karchalla (de Universiteit van de staat van Michigan) voor hulp met optimalisering van de enzymatische reactie, en Dr. Tony Schilmiller (MSU massaspectrometrie en metabolomics faciliteit) bedanken voor hulp bij HRMS data acquisitie.
Materials
| Ammonium Bicarbonate | Sigma | 9830 | NA |
| Ampicillin | GoldBio | A30125 | NA |
| Anhydrous magnesium sulfate | Fisher Scientific | M65-3 | NA |
| Anhydrous methanol | Sigma-Aldrich | 322515 | NA |
| Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421-500 | NA |
| Anhydrous toluene | Sigma-Aldrich | 244511 | NA |
| Arachidonic Acid (AA) | Nu-Chek Prep | U-71A | Air-sensitive. |
| Diethyl Ether | Sigma | 296082 | NA |
| DMSO (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | D8418 | NA |
| Docosahexaenoic Acid (DHA) | Nu-Chek Prep | U-84A | Air-sensitive. |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15576028 | NA |
| Eicosapentaenoic Acid (EPA) | Nu-Chek Prep | U-99A | Air-sensitive. |
| Ethyl acetate | Sigma | 34858 | NA |
| Flash column cartridges 25, 40, 4, 12 g sizes | Fisher Scientific | 145170203, 145154064, 5170200 | Alternatively, conventional column chromatography can be used |
| Formic acid (HPLC Grade) | J.T. Baker | 0128-01 | NA |
| Glycerol | Sigma | G7757 | NA |
| Hexanes | VWR | BDH24575 | NA |
| LB Broth | Sigma | L3022 | NA |
| Lithium hydroxide | Sigma-Aldrich | 442410 | NA |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 2444-01 | NA |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 34860-41-R | NA |
| NADPH Tetrasodium Salt | Sigma-Aldrich | 481973 | Air-sensitive. |
| Oxalic acid | Sigma-Aldrich | 194131 | NA |
| pBS-BM3 transfected DH5α E. coli | NA | NA | NA |
| PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride) | Sigma | P7626 | Toxic! |
| Potassium Permanganate | Sigma-Aldrich | 223468 | For TLC staining. |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496 | NA |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | 795488 | NA |
| Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare life sciences) | Fisher Scientific | 17-0515-01 | For anion exchange purification of enzyme |
| Sodium Chloride | Sigma | 71376 | NA |
| Tetrahydrofuran, anhydrous | Sigma-Aldrich | 186562 | NA |
| TMS-Diazomethane (2.0 M in hexanes) | Sigma-Aldrich | 362832 | Very toxic. |
| Tris-HCl | GoldBio | T-400 | NA |
| Also necessary: | |||
| Automatic flash purification system (we used a Buchi Reveleris X2) | Buchi | ||
| C18 HPLC column (Zorbax Eclipse XDB-C18) | Agilent | ||
| Centrifuge capable of 10,000 x g | |||
| Chiral HPLC Column (Lux cellulose-3), 250 x 4.6 mm, 5 µM, 1000 Å) | Phenomenex | ||
| General chemistry supplies: a 2 L separatory funnel, beakers and Erlenmeyer flasks with 1000-2000 L capacity, 20 mL vials, HPLC vials, small round-bottomed flasks and stir-bars. | |||
| HPLC (we use a Shimadzu Prominence LC-20AT analytical pump and SPD-20A UV-vis detector | Shimadzu | ||
| Nanodrop 2000 Spectrophotometer | Thermo-Fisher Scientific | ||
| NMR | NMR: Agilent DD2 spectrometer (500 MHz) | ||
| Rotary evaporator | Buchi | ||
| Sonic dismembrator or ultrasonic homogenizer | Cole-Parmer |
Referencias
- Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors. Circulation Research. 78, 415-423 (1996).
- Ulu, A., et al. An omega-3 epoxide of docosahexaenoic acid lowers blood pressure in angiotensin-II-dependent hypertension. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64, 87-99 (2014).
- Ye, D., et al. Cytochrome p-450 epoxygenase metabolites of docosahexaenoate potently dilate coronary arterioles by activating large-conductance calcium-activated potassium channels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 303, 768-776 (2002).
- Imig, J. D. Epoxyeicosatrienoic acids, hypertension, and kidney injury. Hypertension. 65, 476-682 (2015).
- Capozzi, M. E., Hammer, S. S., McCollum, G. W., Penn, J. S. Epoxygenated fatty acids inhibit retinal vascular inflammation. Scientific Reports. 6, 39211 (2016).
- Zou, A. P., et al. Stereospecific effects of epoxyeicosatrienoic acids on renal vascular tone and K(+)-channel activity. American Journal of Physiology. 270, F822-F832 (1996).
- Lauterbach, B., et al. Cytochrome P450-dependent eicosapentaenoic acid metabolites are novel BK channel activators. Hypertension. 39, 609-613 (2002).
- Clarke, T. C., Black, T. I., Stussman, B. J., Barnes, P. M., Nahin, R. L. . Trends in the use of complementary health approaches among adults: United States, 2002–2012. , (2015).
- Mozaffarian, D., Wu, J. H. Y. Omega-3 fatty acids and cardiovascular disease. Journal of the American College of Cardiology. 58, 2047-2067 (2011).
- Shearer, G., Harris, W., Pederson, T., Newman, J. Detection of omega-3 oxylipins in human plasma in response to treatment with omega-3 acid ethyl esters. Journal of Lipid Research. 51, 2074-2081 (2010).
- Ostermann, A. I., Schebb, N. H. Effects of omega-3 fatty acid supplementation on the pattern of oxylipins: a short review about the modulation of hydroxy-, dihydroxy-, and epoxy-fatty acids. Food & Function. 8, 2355-2367 (2017).
- Khan, M. A., Wood, P. L. . Method for the synthesis of DHA. , (2012).
- Nanba, Y., Shinohara, R., Morita, M., Kobayashi, Y. Stereoselective synthesis of 17,18-epoxy derivative of EPA and stereoisomers of isoleukotoxin diol by ring-opening of TMS-substituted epoxide with dimsyl sodium. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, 8614-8626 (2017).
- Cinelli, M. A., et al. Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids. Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).
- Falck, J. R., et al. Practical, enantiospecific syntheses of 14,15-EET and leukotoxin B (vernolic acid). Tetrahedron Letters. 41, 4131-4133 (2001).
- Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium. Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).
- Capdevila, J. H., et al. The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3. Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).
- Lucas, D., et al. Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450. Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).
- Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase. Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).
- . Cayman Chemical, 19,20-EpDPA Available from: https://www.caymanchem.com/product/10175 (2019)
- Graham-Lorence, S., et al. An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase. Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).
