Summary

使用膜内消化技术评估蛋白质与蛋白质相互作用

Published: July 19, 2019
doi:

Summary

在这里,我们提出了一个方案,用于制备质谱样本的膜上消化技术。该技术有助于方便分析蛋白质与蛋白质的相互作用。

Abstract

许多细胞内蛋白质根据细胞内和细胞外情况进行物理交互。事实上,细胞功能很大程度上依赖于细胞内蛋白质与蛋白质的相互作用。因此,关于这些相互作用的研究对于促进对生理过程的理解是必不可少的。相关蛋白质的共沉淀,然后进行质谱分析(MS),能够识别新的蛋白质相互作用。在这项研究中,我们详细介绍了免疫沉淀-液相色谱(LC)-MS/MS分析与膜内消化相结合,用于蛋白质与蛋白质相互作用的分析。该技术适用于粗免疫沉淀物,可提高蛋白组分析的通量。标记重组蛋白是使用特定抗体沉淀的;其次,在聚氯丁二烯膜片片上被斑点的免疫沉淀物进行还原烷基化。在胰蛋白酶化后,使用LC-MS/MS对消化的蛋白质残留物进行分析。因此,该方法对新型蛋白质与蛋白质相互作用的表征是方便和有用的。

Introduction

虽然蛋白质在生物体中起着构成作用,但它们在细胞内环境中不断被合成、加工和降解。此外,细胞内蛋白质经常在物理和生物化学上相互作用,这会影响一个或两个1,2,3的功能。例如,将与plissome相关的蛋白同源性CWC22与真核转化启动因子4A3(eIF4A3)直接结合是组装外子结复合物4所必需的。与此一致,一种对CWC22缺乏亲和力的eIF4A3突变体未能促进外子结复合驱动的mRNA拼接4。因此,蛋白质相互作用的研究对于准确理解生理调节和细胞功能至关重要。

质谱学(MS)的最新进展已应用于蛋白质-蛋白质相互作用的综合分析。例如,内源性蛋白质或外源引入标记蛋白及其相关蛋白的共沉淀,然后进行MS分析,能够识别新的蛋白质相互作用5。然而,MS/MS分析的一个主要瓶颈是蛋白质样品的胰蛋白消化不良恢复。用于对细胞解物进行蛋白体分析,通常采用凝胶内和膜内消化技术来制备MS/MS样品。我们之前将凝胶内消化程序与膜内消化技术6进行了比较,并表明后者与更好的序列覆盖率有关。聚苯乙烯二氟化酶 (PVDF) 膜可能适合于此目的,因为它机械坚固,耐高浓度有机溶剂7、8,允许固定的酶消化蛋白质在存在80%醋酸酯9。此外,膜上的固定可以诱导目标蛋白的构象变化,导致胰体消化效率的提高10。因此,在本文中,我们描述了使用膜内消化技术对蛋白质相互作用进行免疫沉淀-LC/MS/MS分析的使用。这种简单的方法便于分析蛋白质-蛋白质相互作用,即使在非专业实验室。

Protocol

1. 免疫沉淀 注:我们使用非硫酸钠(SDS)溶解液缓冲液和柠子酸盐洗脱,如下各节所述。然而,使用替代的内部免疫沉淀技术可能也适用于制备LC-MS/MS样本。 转染培养细胞与载体编码表位标记单独或融合蛋白。为了获得代表性数据,使用载体单独编码绿色荧光蛋白 (GFP)或使用阳离子脂质体处理 GFP 融合 Capn6(calpain-6 基因),传输 J774 细胞(1 x 10 6)。 抗体与磁珠结合?…

Representative Results

通过上述程序,使用LC-MS/MS(图1)对免疫沉淀物进行了分析。排除外源性蛋白质(来自其他物种和IgG的蛋白质)后,在降钙-6相关免疫沉淀物中识别了17种蛋白质(表1),在GFP相关免疫沉淀物中识别了15种蛋白质(表 2)。在降钙-6和GFP相关蛋白中,有11种在两种免疫沉淀物中被识别(图2)。一旦排除这些和降钙酶-6本身,5种?…

Discussion

我们之前已经描述了使用LC-MS/MS在膜上消化技术6之前,在氧化的低密度脂蛋白中对脂蛋白B-100的氧化修饰的分析。在本研究中,我们将该技术与免疫沉淀相结合,并确定了几种与钙痛-6相关的蛋白质。这种新技术代表了筛选候选相关蛋白质的便捷方法。Calpain-6是钙蛋白酶家族11的非蛋白解体成员,据报道,它通过其蛋白质-蛋白质相互作用12、13<…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项研究部分得到了日本科学促进协会KaKENHI赠款号17K09869(至AM)、日本科学促进会KaKENHI赠款号15K09418(至TM)的支持,这是来自Kanehara Ichiro医学科学基金会的一笔研究补助金。和苏津纪念基金会的研究补助金(全部给TM)。

Materials

Acetonitrile Wako 014-00386
Citric acid Wako 030-05525
DiNA KYA Tech Co. nanoflow high-performance liquid chromatography
DiNa AI KYA Tech Co. nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler
DTT Nacalai tesque 14112-94
Dynabeads protein G Thermo Fisher Scientific 10003D
Formic acid Wako 066-00461
HiQ Sil C18W-3 KYA Tech Co. E03-100-100 0.10mmID * 100mmL
Iodoacetamide Wako 095-02151
Lipofectamine 3000 Thermo Fisher Scientific L3000008
Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) Clontech 632380
NaCl Wako 191-01665
NH4HCO3 Wako 018-21742
Nonidet P-40 Sigma N6507 poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9)
peptide standard KYA Tech Co. tBSA-04 tryptic digests of bovine serum albumin
PP vial KYA Tech Co. 03100S plastic sample tube
Protease inhibitor cooctail Sigma P8465
ProteinPilot software Sciex 5034057 software for protein identification
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111 trypsin
Sodium orthovanadate Sigma S6508
Sodium phosphate dibasic dihydrate Sigma 71643
TFA Wako 206-10731
trap column KYA Tech Co. A03-05-001 0.5mmID * 1mmL
TripleTOF 5600 system Sciex 4466015 Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer
Tris Wako 207-06275
Tween-20 Wako 160-21211

Referencias

  1. Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. Co-translational protein folding: progress and methods. Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).
  2. Miyazaki, T., Miyazaki, A. Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79 (2017).
  3. Miyazaki, T., Miyazaki, A. Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).
  4. Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly. Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).
  5. Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).
  6. Obama, T., et al. Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS. Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).
  7. Matsudaira, P. Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).
  8. Yamaguchi, M., et al. High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).
  9. Iwamatsu, A. S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing. Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).
  10. Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems. Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).
  11. Miyazaki, T., Miyazaki, A. Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).
  12. Miyazaki, T., et al. Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).
  13. Tonami, K., et al. Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1. Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).
  14. Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. Protein elongation, co-translational folding and targeting. Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).
  15. Bunai, K., et al. Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile. Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).

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Obama, T., Miyazaki, T., Aiuchi, T., Miyazaki, A., Itabe, H. Evaluation of Protein–Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique. J. Vis. Exp. (149), e59733, doi:10.3791/59733 (2019).

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