Bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi
Summary
Burada, kütle spektrometresi için numunelerin hazırlanması için bir on-membran sindirim tekniği için bir protokol sunuyoruz. Bu teknik, protein-protein etkileşimlerinin uygun analizini kolaylaştırır.
Abstract
Çok sayıda hücre içi proteinler, hücre içi ve hücre dışı koşullara uygun olarak fiziksel olarak etkileşime girebilir. Nitekim, hücresel fonksiyonlar büyük ölçüde hücre içi protein-protein etkileşimleri bağlıdır. Bu nedenle, bu etkileşimler hakkında araştırma fizyolojik süreçlerin anlaşılması kolaylaştırılması için vazgeçilmez. İlişkili proteinlerin ortak yağış, ardından kütle spektrometresi (MS) analizi, yeni protein etkileşimlerini tanımlamanıza olanak sağlar. Bu çalışmada, protein-protein etkileşimlerinin analizinde membran sindirimi ile birlikte immünopetoziteksiyon-sıvı kromatografi (LC)-MS/MS analizinin yeni tekniğinin ayrıntılarını sağdık. Bu teknik, ham immünopantitants için uygundur ve proteomik analizlerin verimi artırabilir. Etiketlenmiş rekombinant proteinler belirli antikorlar kullanılarak çöktürülmüş; Sonraki, Poliviniliden difluorid membran parçaları üzerine şişkinlik immünoprecipitants redüktif alkilasyon maruz kalmıştır. Tripsinizasyon sonrasında, sindirilmiş protein kalıntıları LC-MS/MS kullanılarak incelenmiştir. bu tekniği kullanarak, birkaç aday ilişkili proteini tespit edebildik. Böylece, bu yöntem uygun ve yeni protein-protein etkileşimleri karakterizasyonu için yararlıdır.
Introduction
Proteinler yaşayan organizmalarda kurucu roller oynamakla birlikte, hücre içi ortamlarda sürekli sentezlenmiş, işlenir ve bozulur. Ayrıca, hücre içi proteinler sıklıkla fiziksel ve biyokimyasal olarak etkileşime girebilir, bu da1,2,3‘ ün fonksiyonunu etkiler. Örneğin, spliceosome ile ilişkili protein homolog CWC22 ökaryotik çeviri başlatma faktörü 4A3 (eIF4A3) ile doğrudan bağlama, eXoN Junction Complex4‘ ün montajı için gereklidir. Bu ile tutarlı, CWC22 için benzeşimi bulunmayan bir eIF4A3 mutant eXoN kavşak karmaşık güdümlü mRNA yapıştırma4kolaylaştırmak için başarısız olur. Böylece, protein etkileşimlerinin incelenmesi, fizyolojik düzenlemenin yanı sıra hücresel fonksiyonların kesin anlayışı için çok önemlidir.
Kütle spektrometresi (MS) ‘ deki son gelişmeler protein-protein etkileşimlerinin kapsamlı analizine uygulanmıştır. Örneğin, endojen proteinlerin Co-yağış veya exogenously ilişkili proteinleri ile etiketlenmiş proteinleri tanıttı, MS Analizi tarafından izlenen, yeni protein etkileşimleri belirlenmesi sağlar5. Ancak, MS/MS analizinin büyük bir darboğaz protein numunelerinin triptik diyetleri kötü kurtarma olduğunu. Hücre Lysates üzerinde proteomik analizler yapmak için, in-jel ve on-membran sindirim teknikleri genellikle MS/MS örnekleri hazırlamak için kullanılmaktadır. Daha önce bir on-membran sindirim tekniği ile bir in-jel sindirim prosedürü karşılaştırdık6, ve ikinci daha iyi sıra kapsamı ile ilişkili olduğunu gösterdi. Polyvinylidene difluorid (PVDF) membran bu amaçla uygun olabilir, çünkü mekanik olarak sağlam ve yüksek konsantrasyonlarda organik çözücüler için dayanıklı7,8, immobilize enzimatik sindirim izin % 80 Asetonitril9varlığında proteinler. Ayrıca, bir membran üzerinde immobilizasyon hedef proteinlerde Konformasyonel değişiklikleri neden olabilir, triptic sindirim verimliliği iyileştirmeler yol10. Buna göre, bu yazıda, bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein etkileşimlerinin ımantioprecipitation-LC/MS/MS analizinin kullanımını tarif ettik. Bu basit yöntem, uzman olmayan laboratuvarlarda bile protein-protein etkileşimlerinin uygun analizini kolaylaştırır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Daha önce bir on-membran sindirim tekniği6Ile önceden LC-MS/MS kullanarak okside düşük yoğunluklu lipoprotein apolipoprotein B-100 oksidatif modifikasyonları bir analiz tarif ettik. Bu çalışmada, bu tekniği immünopresipitasyon ile birleştirdik ve birkaç calpain-6-ilişkili protein tespit ettik. Bu roman tekniği, aday ilişkili proteinler için tarama uygun bir yöntem temsil eder. Kalpain-6, protein-protein etkileşimi12,13…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada bilim kakenhi Grant numarası 17K09869 (AM), bilim KAKENHI Grant numarası 15K09418 (TM), tanıtımı için Japonya Derneği tanıtımı için Japonya toplum tarafından kısmen destekleniyordu Kanehara Ichiro tıp bilimi Vakfı bir araştırma hibe ve Suzuken Memorial Vakfı (tüm TM) bir araştırma hibe.
Materials
| Acetonitrile | Wako | 014-00386 | |
| Citric acid | Wako | 030-05525 | |
| DiNA | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography | |
| DiNa AI | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler | |
| DTT | Nacalai tesque | 14112-94 | |
| Dynabeads protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| Formic acid | Wako | 066-00461 | |
| HiQ Sil C18W-3 | KYA Tech Co. | E03-100-100 | 0.10mmID * 100mmL |
| Iodoacetamide | Wako | 095-02151 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | Clontech | 632380 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NH4HCO3 | Wako | 018-21742 | |
| Nonidet P-40 | Sigma | N6507 | poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9) |
| peptide standard | KYA Tech Co. | tBSA-04 | tryptic digests of bovine serum albumin |
| PP vial | KYA Tech Co. | 03100S | plastic sample tube |
| Protease inhibitor cooctail | Sigma | P8465 | |
| ProteinPilot software | Sciex | 5034057 | software for protein identification |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | trypsin |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 71643 | |
| TFA | Wako | 206-10731 | |
| trap column | KYA Tech Co. | A03-05-001 | 0.5mmID * 1mmL |
| TripleTOF 5600 system | Sciex | 4466015 | Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer |
| Tris | Wako | 207-06275 | |
| Tween-20 | Wako | 160-21211 |
Referencias
- Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. Co-translational protein folding: progress and methods. Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).
- Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly. Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).
- Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).
- Obama, T., et al. Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS. Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).
- Matsudaira, P. Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).
- Yamaguchi, M., et al. High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).
- Iwamatsu, A. S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing. Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).
- Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems. Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).
- Miyazaki, T., et al. Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).
- Tonami, K., et al. Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1. Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).
- Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. Protein elongation, co-translational folding and targeting. Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).
- Bunai, K., et al. Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile. Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).
