Generering av inducerade neurala stamceller från perifera mononukleära celler och differentiering mot dopaminerga neuron prekursorer för transplantations studier

Parkinsons sjukdom (PD) är en vanlig neurodegenerativ sjukdom, orsakad av degeneration av dopaminerga (DA) nervceller vid substantia nigra pars compacta (SNpc) i ventrala mesencephalon (VM), med en prevalens av mer än 1% i befolkningen över 60 års ålder ^{1 , 2}. under det senaste decenniet, cellterapi, som syftar till att antingen ersätta de degenerativa eller skadade celler, eller näring mikromiljön runt degenererade neuroner, har visat potential i behandling av PD³. Samtidigt har omprogrammeringsteknik gjort betydande framsteg⁴, vilket ger en lovande cellulär källa för substitutionsterapi. Humana inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) och embryonala stamceller (ESCs) har visat sig kunna differentiera till DA neurala celler, som kan överleva, mognad, och förbättra motoriska funktioner när ympas till råtta och icke-mänskliga primater PD-modeller^{5 ,6,7,8}. iPSCs utgör en milstolpe i cellulära omprogrammeringstekniker och har en stor potential vid celltransplantation. emellertid, det finns fortfarande en oro över risken för tumör bildning från ofullständigt differentierade celler. En alternativ cellulär källa för celltransplantation är härstamning-engagerade adulta stamceller erhållna genom direkt omprogrammering, såsom inducerade neurala stamceller (iNSCs), som kan härledas från de instabila intermediaterna, som förbigår pluripotensen etapp^9,10,11.

Både iPSCs och inscs kan omprogrammeras från autolodiga cellulära källor, såsom fibroblaster, perifera mononukleära blodceller (pbmncs) och olika andra typer av celler^12,13,14, vilket minskar Immunogenicitet av transplanterade celler i hög grad. Dessutom, jämfört med iPSCs, iNSCs är inneboende med minskad risk för tumör bildning och härstamning-engagerade plasticitet, endast kunna differentiera till nervceller och glia¹¹. I de första studierna, mänskliga eller mus iPSCs och inscs genererades från fibroblaster erhållits från hudbiopsier, vilket är ett invasivt förfarande^14,15. Med detta avseende, PBMNCs är en tilltalande förrätt cell källa på grund av den mindre invasiva provtagning processen, och lätt att få ett stort antal celler inom en kort period av expansionstid¹⁶. Inledande omprogrammering studier anställda integrativ leveranssystem, såsom lentivirala eller retrovirala vektorer, som är effektiva och lätta att genomföra i många typer av celler¹⁷; dessa leveranssystem kan dock orsaka mutationer och reaktivering av kvarvarande transgener, som utgör säkerhetsfrågor för kliniska terapeutiska ändamål¹². Sendai virus (SeV) är en icke-integrativ RNA-virus med en negativ känsla, enkelsträngad arvsmassa som inte integreras i värd arvsmassan, men bara replikat i cytoplasman hos infekterade celler, som erbjuder ett effektivt och säkert fordon för omprogrammering^{18 ,19}. Rekombinanta SeV vektorer finns tillgängliga som innehåller omprogrammering faktorer inklusive Human OCT3/4, SOX2, KLF4 och c-MYC i sina öppna Läs ramar. Dessutom kan SeV virusvektorer förbättras ytterligare genom att införa temperaturkänsliga mutationer, så att de snabbt kan avlägsnas när odlings temperaturen höjs till 39 ° c²⁰. I den här artikeln beskriver vi ett protokoll för att programmera PBMNCs till iNSCs med hjälp av SeV-systemet.

Många studier har rapporterat härledning av da neuroner från mänskliga ESCs eller iPSCs med hjälp av olika metoder^6,8,21. Emellertid, det finns en brist på protokoll som beskriver differentiering av DA neuroner från iNSCs i detaljer. I detta protokoll kommer vi att beskriva den effektiva generationen av DA-neuroner från iNSCs med hjälp av en tvåstegs metod. DA neuronala prekursorer kan transplanteras in i striatum av PD musmodeller för säkerhet och effekt utvärderingar. Denna artikel kommer att presentera ett detaljerat protokoll som täcker olika stadier från generering av inducerad neurala stamceller av Sendai virus, differentiering av iNSCs i DA neuroner, inrättande av mus PD-modeller, till transplantation av DA prekursorer i striatum av PD-modellerna. Med hjälp av detta protokoll kan man generera iNSCs från patienter och friska donatorer och härleda DA neuroner som är säkra, standardiserade, skalbara och homogena för celltransplantation ändamål, eller för modellering PD i en maträtt och utredning av mekanismerna bakomliggande sjukdomsdebut och utveckling.