Generazione di cellule staminali neurali indotte da cellule mononucleari periferiche e differenziazione verso i precursori dei neuroni dopaminergici per gli studi di trapianto

Il morbo di Parkinson (PD) è un disturbo neurodegenerativo comune, causato dalla degenerazione dei neuroni dopaminergici (DA) alla substantia nigra pars compacta (SNpc) nella mesincephalon ventrale (VM), con una prevalenza di oltre l’1% della popolazione sopra i 60 anni di età ^{1 : il} nome del ^{, 2}. Nell’ultimo decennio, la terapia cellulare, volta a sostituire le cellule degenerative o danneggiate, o a nutrire il microambiente intorno ai neuroni degeneranti, ha mostrato un potenziale nel trattamento della PD³. Nel frattempo, la tecnologia di riprogrammazione ha fatto progressi significativi⁴, che fornisce una fonte cellulare promettente per la terapia sostitutiva. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo (iPSC) e le cellule staminali embrionali (ESC) hanno dimostrato di essere in grado di differenziarsi nelle cellule neurali DA, che potrebbero sopravvivere, maturarsi e migliorare le funzioni motorie quando innestate nei modelli di PD di ratti e primati non umani^{5 ,6,7,8}. Gli iPSC rappresentano una pietra miliare nelle tecnologie di riprogrammazione cellulare e hanno un grande potenziale nel trapianto di cellule; tuttavia, c’è ancora una preoccupazione circa il rischio di formazione del tumore dalle cellule incompletamente differenziate. Una fonte cellulare alternativa per il trapianto di cellule è costituita da cellule staminali adulte impegnate nel lignaggio ottenute attraverso la riprogrammazione diretta, come le cellule staminali neurali indotte (iNSC), che possono essere derivate dagli intermedi instabili, bypassando la pluripotenza fase^9,10,11.

Sia gli iPSC che gli iNSC possono essere riprogrammati da fonti cellulari autologhe, come fibroblasti, cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCNC) e vari altri tipi di cellule^12,13,14, riducendo così la immunogenicità delle cellule trapiantate in gran parte. Inoltre, rispetto agli iPSC, gli iNSC sono intrinseci con ridotto rischio di formazione del tumore e plasticità impegnata nel lignaggio, solo in grado di differenziarsi in neuroni e glia¹¹. Negli studi iniziali, iPSC umani o topi e iNSC sono stati generati da fibroblasti ottenuti da biopsie cutanee, che è una procedura invasiva^14,15. A questo proposito, i PBMNC Sono una fonte di cellule di partenza attraente a causa del processo di campionamento meno invasivo e della facilità di ottenere un gran numero di cellule entro un breve periodo di tempo di espansione¹⁶. Gli studi iniziali di riprogrammazione hanno impiegato sistemi di erogazione integrativi, come vettori lentivirali o retrovirali, che sono efficienti e facili da implementare in molti tipi di cellule¹⁷; tuttavia, questi sistemi di somministrazione possono causare mutazioni e riattivazione di transgeni residui, che presentano problemi di sicurezza per scopi terapeutici clinici¹². Il virus Sendai (SeV) è un virus RNA non integrativo con un genoma a singolo filamento negativo che non si integra nel genoma dell’ospite, ma si replica solo nel citoplasma delle cellule infette, offrendo un veicolo efficiente e sicuro per la riprogrammazione^{18 ,19}. Sono disponibili vettori SeV ricombinanti che contengono fattori di riprogrammazione, tra cui l’oggetto OCT3/4, SOX2, KLF4 e c-MYC nei frame di lettura aperti. Inoltre, i vettori virali SeV possono essere ulteriormente migliorati introducendo mutazioni sensibili alla temperatura, inmodo che possano essere rapidamente rimossi quando la temperatura di coltura viene aumentata a 39 . In questo articolo viene descritto un protocollo per riprogrammare i PBMNN in iNSC utilizzando il sistema SeV.

Molti studi hanno riportato la derivazione di neuroni DA da ESC umani o iPSC utilizzando vari metodi^6,8,21. Tuttavia, c’è una carenza di protocolli che descrivono la differenziazione dei neuroni DA da iNSC nei dettagli. In questo protocollo, descriveremo la generazione efficiente di neuroni DA da iNSC utilizzando un metodo a due stadi. I precursori neuronali DA possono essere trapiantati nello striato dei modelli murini della PD per le valutazioni di sicurezza ed efficacia. Questo articolo presenterà un protocollo dettagliato che copre varie fasi dalla generazione di cellule staminali neurali indotte dal virus Sendai, la differenziazione di iNSC in neuroni DA, la creazione di modelli di PD murino, al trapianto di precursori DA nello striato dei modelli PD. Utilizzando questo protocollo, si possono generare iNSC da pazienti e donatori sani e derivare neuroni DA sicuri, standardizzati, scalabili e omogenei ai fini del trapianto di cellule, o per la modellazione della PD in un piatto e lo studio dei meccanismi l’insorgenza e lo sviluppo della malattia sottostante.