Lipidomica e trascrittomica nelle malattie neurologiche

I recenti progressi nella funzione dei lipidi e il loro ruolo nell’insorgenza e nella progressione delle malattie neurologiche aprono nuove sedi di ricerca e sviluppo di nuovi bersagli terapeutici e delucidazione del meccanismo della ^malattia1. Le differenze documentate nella composizione lipidica in diverse regioni del cervello, enfatizzate dalle moderne tecniche di imaging molecolare come l’imaging con spettrometria di massa e la profilazione avanzata della spettrometria di massa, spostano il paradigma dell’indagine lipidica dall’intero cervello verso regioni cerebrali funzionalmente distinte e discrete. Il fatto che la composizione lipidica vari nelle diverse regioni del cervello induce a una nuova concettualizzazione sia della sensibilità lipidica di membrana che della segnalazione lipidica a valle in risposta a un insulto o stimoli cerebrali attraverso le regioni cerebrali funzionalmente distinte. Pertanto, i protocolli lipidici richiedono nuovi sviluppi per affrontare la sfida di basse quantità di tessuto per il rilevamento e la quantificazione di una risoluzione spaziale più elevata e, contemporaneamente, l’analisi di più componenti lipidici delle membrane cellulari e delle vie di segnalazione. Inoltre, la determinazione di enzimi, ligandi lipidici e recettori coinvolti nella regolazione dei loro livelli e della loro funzione è fondamentale per chiarire le vie di segnalazione colpite in una malattia neurologica e guidare nuove indagini meccanicistiche in un contesto fisiopatologico.

Oltre all’aumento della risoluzione spaziale del cervello, ci sono due grandi difficoltà che sfidano lo sviluppo di nuovi approcci neurolipidomici. In primo luogo, le molecole di segnalazione lipidica sono tipicamente di abbondanza molto bassa rispetto ai lipidi costitutivi di membrana. In secondo luogo, il lipidoma presenta un’elevata eterogeneità strutturale, difficile da sezionare utilizzando un unico approccio analitico. Quindi, i metodi di estrazione e analisi sono adattati a diverse categorie lipidiche e comunemente eseguiti in campioni di tessuto distinti². Metodi lipidomici shotgun³ sono strumenti eccellenti per rivelare rapidamente un ampio profilo dei lipidi di membrana, mentre l’aumento della sensibilità e della selettività offerte dalla scoperta mirata e dalla quantificazione dei metodi spettrometrici di massa sono capitalizzati per lo studio di lipidi di segnalazione a bassa abbondanza tra cui: i) lipidi infiammatori e ii) lipidi coinvolti nella modulazione dell’attività neuronale, come endocannabinoidi (eCB), lipidi legati agli amminoacidi, and so on.^4,5. Per comprendere i cambiamenti lipidici sia a livello di membrana cellulare che di segnalazione che si verificano nelle regioni cerebrali dei modelli di malattie neurologiche, in genere l’estrazione e l’analisi dei lipidi vengono eseguite in campioni di tessuto distinti, ottenuti da lotti animali distinti o da emisferi diversi, o sezionando una regione tissutale più ampia in più pezzi. Quando anche i livelli di mRNA dei recettori enzimatici sono di interesse, la loro indagine richiede in genere l’approvvigionamento di un campione di tessuto distinto. Ad esempio, lo studio dei lipidi di membrana, dei cannabinoidi endogeni e dell’mRNA richiederebbe tre diversi campioni di tessuto (ad esempio, due campioni per i due metodi di estrazione dei lipidi – lipidi di membrana e lipidi di segnalazione – e successivi due metodi di analisi dei lipidi – e un campione per l’analisi dell’mRNA). Lo studio dei lipidi infiammatori e dei cannabinoidi endogeni richiede due distinti campioni di tessuto, metodi di estrazione e metodi di analisi, rispettivamente. Un altro esempio è lo studio dell’mRNA e di qualsiasi categoria lipidica in un campione di punch cerebrale o di microdissezione laser che di conseguenza richiede due animali distinti per procurarsi due campioni per (sotto)regione del cervello. In questi casi si verifica frequentemente una notevole variabilità e/o scarsa riproducibilità dei risultati, derivante dalla variabilità biologica e/o dall’eterogeneità tissutale. Guidato da queste limitazioni pratiche dell’analisi multimolecolare, che si verificano in particolare ad alta risoluzione spaziale nel cervello, è stato progettato un protocollo di neurolipidomica a tre moduli che comprende: 1) coestrazione e co-analisi da parte di LC / MRM di lipidi infiammatori (ad esempio, eicosanoidi (eiCs)) e lipidi coinvolti nella modulazione dell’attività neuronale, come gli eCB²; 2) co-estrazione di fosfolipidi (PL) ed eCB con successiva analisi multiscan LC/MRM e precursor/neutral loss scan²; e 3) doppia estrazione di lipidi di membrana (fosfo)lipidi ed eCB nonché di mRNA, con successiva analisi di sequenziamento LC/MRM e qPCR o RNA⁶. A seconda della questione biologica da affrontare in una malattia neurologica e della regione cerebrale di interesse, una combinazione del primo e del secondo protocollo, o del primo e del terzo protocollo, può essere applicata sullo stesso campione di tessuto per tessuti di peso di circa 4 mg. Il primo e il terzo protocollo possono essere applicati in modo indipendente per i tessuti intorno ai 2 mg. Il secondo protocollo può essere applicato per tessuti di peso minimo di 0,5 mg. Indipendentemente dal modulo di protocollo neurolipidomico selezionato, il campionamento dei tessuti e l’elaborazione pre-analitica, l’isolamento cerebrale e la dissezione della regione, nonché la procedura per sacrificare il modello animale sono standardizzati e identici per tutti e tre i moduli del protocollo. Nella nostra indagine sulle malattie neurologiche, gli organi periferici che sono rilevanti per le conseguenze patologiche della malattia vengono sempre raccolti e analizzati utilizzando questi protocolli modulari. Inoltre, il sangue viene regolarmente campionato per la lipidomica plasmatica per servire come strumento di lettura delle malattie neurologiche in vista di potenziali applicazioni traslazionali. Il protocollo lipidomico modulare qui presentato è molto versatile: scalabile a quantità di tessuto più grandi e facilmente applicabile praticamente a qualsiasi tipo di tessuto e malattia. Per l’applicazione del protocollo modulare (Figura 1) nelle malattie neurologiche, qualsiasi modello standardizzato di roditori di insorgenza e progressione di disturbi neurologici, come lesioni cerebrali traumatiche, morbo di Parkinson, morbo di Alzheimer o epilessia sono suscettibili.

Questi protocolli sono stati ampiamente applicati per studiare i cambiamenti nel lipidoma tissutale e/o nel trascrittoma nella fase acuta dell’epilessia nel modello murino di epilessia indotto dall’acido kainico (KA^)2,7, un modello ampiamente utilizzato negli studi preclinici a causa della somiglianza con l’epilessia del lobo temporale umano (TLE)^8,9,10,11. Utilizzando questi protocolli, il potenziale terapeutico di farmaci come palmitoiletanolamide (PEA)^12,13 è stato valutato nello stesso modello murino di epilessia. Lo studio ha identificato cambiamenti lipidici e mRNA ad alta e bassa risoluzione spaziale nel cervello e nella periferia, nel punto temporale delle intensità massime di convulsioni acute (a 60 minuti di induzione post-epilettica) e dopo il trattamento subcronico e acuto con PEA in quattro diversi punti temporali (20, 60, 120 e 180 min) dopo l’induzione della crisi ka, una finestra temporale che copre la fase acuta dell’epilessia. Plasma, cervello e organi periferici di topi iniettati con KA non trattati, topi acuti e subcronicamente trattati con PEA, così come topi di controllo veicolo e PEA-veicolo, sono stati raccolti in ogni punto ^{temporale12,13} e studiati con questa analisi molecolare. I dati molecolari sono stati correlati con fenotipi comportamentali ottenuti dal seizure scoring, nonché con dati derivati dall’immunoistochimica sui processi neurodegenerativi, al fine di svelare la progressione della fase di epilessia acuta e il potenziale della PEA per alleviarla.