Lipidomik und Transkriptomik bei neurologischen Erkrankungen

Jüngste Fortschritte in der Funktion von Lipiden und ihrer Rolle bei der Entstehung und dem Fortschreiten neurologischer Erkrankungen eröffnen neue Forschungs- und Entwicklungsmöglichkeiten für neue therapeutische Ziele und die Aufklärung von Krankheitsmechanismen1. Dokumentierte Unterschiede in der Lipidzusammensetzung in verschiedenen Hirnregionen, die durch moderne molekulare Bildgebungsverfahren wie Massenspektrometrie-Bildgebung und fortschrittliche Massenspektrometrie-Profilierung betont werden, verschieben das Paradigma der Lipiduntersuchung vom gesamten Gehirn hin zu funktionell unterschiedlichen und diskreten Hirnregionen. Die Tatsache, dass die Lipidzusammensetzung in verschiedenen Gehirnregionen variiert, führt zu einer neuen Konzeptualisierung sowohl der Membranlipidempfindlichkeit als auch der nachgeschalteten Lipidsignalisierung als Reaktion auf eine Hirnverletzung oder -reize in den funktionell unterschiedlichen Hirnregionen. Daher erfordern Lipidprotokolle neue Entwicklungen, um die Herausforderung niedriger Gewebemengen für die Erkennung und Quantifizierung mit höherer räumlicher Auflösung und gleichzeitig die Analyse mehrerer Lipidkomponenten von Zellmembranen und Signalwegen zu bewältigen. Auch die Bestimmung von Enzymen, Lipidliganden und Rezeptoren, die an der Regulation ihrer Spiegel und Funktion beteiligt sind, ist von größter Bedeutung, um die bei einer neurologischen Erkrankung betroffenen Signalwege aufzuklären und neue mechanistische Untersuchungen in einem pathophysiologischen Kontext zu leiten.

Neben der erhöhten räumlichen Auflösung des Gehirns gibt es zwei große Schwierigkeiten, die die Entwicklung neuer neurolipidomischer Ansätze herausfordern. Erstens sind die Lipidsignalmoleküle im Vergleich zu membrankonstitutiven Lipiden typischerweise von sehr geringer Häufigkeit. Zweitens weist das Lipidom eine hohe strukturelle Heterogenität auf, die mit einem einzigen analytischen Ansatz schwer zu sezieren ist. Daher sind Extraktions- und Analysemethoden auf verschiedene Lipidkategorien zugeschnitten und werden üblicherweise in verschiedenen Gewebeproben durchgeführt.². Shotgun lipidomische Methoden³ sind ausgezeichnete Werkzeuge, um schnell ein breites Profil von Membranlipiden aufzudecken, während eine erhöhte Empfindlichkeit und Selektivität, die durch die gezielte Entdeckung und Quantifizierung von massenspektrometrischen Methoden ermöglicht wird, für die Untersuchung von Signallipiden mit geringer Häufigkeit genutzt werden, darunter: i) Entzündungslipide und ii) Lipide, die an der Modulation der neuronalen Aktivität beteiligt sind, wie Endocannabinoide (eCBs), Aminosäure-verknüpfte Lipide, etc.^4,5. Um Lipidveränderungen sowohl auf Zellmembran- als auch auf Signalebene zu erfassen, die in Gehirnregionen neurologischer Krankheitsmodelle auftreten, werden die Lipidextraktion und -analyse typischerweise in verschiedenen Gewebeproben durchgeführt, die aus verschiedenen Tierchargen oder aus verschiedenen Hemisphären gewonnen werden, oder indem eine größere Geweberegion in mehrere Stücke zerlegt wird. Wenn auch die mRNA-Spiegel von Enzymrezeptoren von Interesse sind, erfordert ihre Untersuchung typischerweise die Beschaffung einer eindeutigen Gewebeprobe. Zum Beispiel würde die Untersuchung von Membranlipiden, endogenen Cannabinoiden und mRNA drei verschiedene Gewebeproben erfordern (z. B. zwei Proben für die beiden Lipidextraktionsmethoden – Membranlipide und Signallipide – und anschließend zwei Lipidanalysemethoden – und eine Probe für die mRNA-Analyse). Die Untersuchung von Entzündungslipiden und endogenen Cannabinoiden erfordert zwei verschiedene Gewebeproben, Extraktionsmethoden bzw. Analysemethoden. Ein weiteres Beispiel ist die Untersuchung von mRNA und jeder Lipidkategorie in einer Gehirnstanz- oder Laser-Mikrodissektionsprobe, die folglich zwei verschiedene Tiere benötigt, um zwei Proben pro Gehirn(sub)region zu beschaffen. In solchen Fällen tritt häufig ein erhebliches Maß an Variabilität und/oder schlechter Reproduzierbarkeit der Ergebnisse auf, das auf biologische Variabilität und/oder Gewebeheterogenität zurückzuführen ist. Geleitet von diesen praktischen Einschränkungen der multimolekularen Analyse, die insbesondere bei hoher räumlicher Auflösung im Gehirn auftritt, wurde ein dreimoduliges Neurolipidomik-Protokoll entwickelt, das Folgendes umfasst: 1) Koextraktion und Co-Analyse durch LC / MRM von entzündlichen Lipiden (z. B. Eicosanoide (EiCs)) und Lipiden, die an der Modulation der neuronalen Aktivität beteiligt sind, wie z. B. eCBs²; 2) Co-Extraktion von Phospholipiden (PLs) und eCBs mit anschließender Multiscan LC/MRM und Precursor/Neutral Loss Scan Analyse²; und 3) duale Extraktion von Membran(phospho)lipiden und eCBs sowie mRNA, mit anschließender LC/MRM- und qPCR- oder RNA-Sequenzierungsanalyse⁶. Abhängig von der biologischen Fragestellung, die bei einer neurologischen Erkrankung behandelt werden soll, und der interessierenden Hirnregion kann eine Kombination aus dem ersten und dem zweiten Protokoll oder dem ersten und dritten Protokoll auf dieselbe Gewebeprobe für Gewebe mit einem Gewicht von etwa 4 mg angewendet werden. Das erste und dritte Protokoll können unabhängig voneinander für Gewebe um 2 mg angewendet werden. Das zweite Protokoll kann für Gewebe mit einem Gewicht von nur 0,5 mg angewendet werden. Unabhängig vom gewählten neurolipidomischen Protokollmodul sind die Gewebeentnahme und präanalytische Verarbeitung, die Hirnisolation und Regionsektion sowie das Verfahren zur Opferung des Tiermodells für alle drei Module des Protokolls standardisiert und identisch. Bei unserer Untersuchung neurologischer Erkrankungen werden mit diesen modularen Protokollen immer auch periphere Organe, die für die pathologischen Folgen der Erkrankung relevant sind, gesammelt und analysiert. Darüber hinaus wird regelmäßig Blut für die Plasmalipidomik entnommen, um als Auslesewerkzeug für neurologische Erkrankungen mit Blick auf prospektive translationale Anwendungen zu dienen. Das hier vorgestellte modulare Lipidomik-Protokoll ist sehr vielseitig: skalierbar auf größere Gewebemengen und leicht anwendbar für praktisch jeden Gewebetyp und jede Krankheit. Für die Anwendung des modularen Protokolls (Abbildung 1) bei neurologischen Erkrankungen ist jedes standardisierte Nagetiermodell für den Beginn und das Fortschreiten neurologischer Störungen wie Schädel-Hirn-Trauma, Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit oder Epilepsie zugänglich.

Diese Protokolle wurden umfassend angewendet, um Veränderungen des Gewebelipidoms und/oder Transkriptoms in der akuten Phase der Epilepsie im Kainsäure (KA)-induzierten Mausmodell der Epilepsie zu ^{untersuchen2,7}, einem Modell, das in präklinischen Studien aufgrund der Ähnlichkeit mit der menschlichen Temporallappenepilepsie (TLE) häufig verwendet wird ^8,9,10,11. Unter Verwendung dieser Protokolle wurde das therapeutische Potenzial von Arzneimitteln wie Palmitoylethanolamid (PEA)^12,13 im selben Mausmodell für Epilepsie untersucht. Die Studie identifizierte Lipid- und mRNA-Veränderungen mit hoher und niedriger räumlicher Auflösung im Gehirn und in der Peripherie, zum Zeitpunkt der maximalen akuten Anfallsintensitäten (bei 60 Minuten posteizürischer Induktion) und bei subchronischer und akuter Behandlung mit PEA zu vier verschiedenen Zeitpunkten (20, 60, 120 und 180 min) nach der KA-Anfallsinduktion, einem Zeitfenster, das die akute Phase der Epilepsie abdeckt. Plasma, Gehirne und periphere Organe von unbehandelten KA-injizierten Mäusen, akuten und subchron PEA-behandelten Mäusen sowie Vehikel- und PEA-Vehikel-Kontrollmäusen wurden zu jedem Zeitpunkt ^{gesammelt12,13} und mit dieser molekularen Analyse untersucht. Die molekularen Daten korrelierten mit Verhaltensphänotypen, die durch Anfallsbewertung erhalten wurden, sowie mit immunhistochemisch abgeleiteten Daten zu neurodegenerativen Prozessen, um das Fortschreiten der akuten Epilepsiephase und das Potenzial von PEA, sie zu lindern, zu entschlüsseln.