Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

En fluorescens-basert metode å studere bakteriell Gene regulering i infiserte vev

Published: February 19, 2019 doi: 10.3791/59055
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Georgetown University

Summary

Beskrevet her er en metode for å analysere bakteriell genuttrykk dyr vev på cellenivå. Denne metoden gir en ressurs for å studere fenotypiske mangfoldet innenfor en bakteriell befolkning svar på vev miljøet under en infeksjon.

Abstract

Bakteriell virulens gener er ofte regulert på transcriptional nivå av flere faktorer som svarer til ulike Miljøsignaler. Noen faktorer handle direkte på virulens gener; andre kontrollere patogenesen ved å justere uttrykk for nedstrøms regulatorer eller akkumulering av signaler som påvirker regulator aktivitet. Mens regulering har vært studert under i vitro vekst, er relativt lite kjent om hvordan genuttrykk justeres under infeksjon. Slik informasjon er viktig når en bestemt gen er en kandidat for terapeutisk intervensjon. Transcriptional tilnærminger som kvantitative, real-time RT PCR og RNA-Seq er effektive måter å undersøke genuttrykk på globalt nivå men lider mange tekniske utfordringer, inkludert lav overflod av bakteriell forhold til verten RNA og utvalg degradering av RNases. Evaluere regulering med fluorescerende journalister er relativt lett og kan være multiplekset med fluorescerende proteiner med unike spectral egenskaper. Metoden gir encellede, spatiotemporal analyse av genuttrykk i vev som viser komplekse tredimensjonale arkitektur og physiochemical forløpninger som påvirker bakteriell regulatoriske nettverk. Slik informasjon er tapt når dataene er gjennomsnitt over bulk befolkningen. Her, beskriver vi en metode for å kvantifisere byggkorn under bakteriell patogener i situ. Metoden er basert på enkel vev behandling og direkte observasjon av fluorescens fra reporter proteiner. Vi viser nytten av dette systemet ved å undersøke uttrykket av Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), med gene produktet kreves for immun evasion og full virulens ex vivo og in vivo. Vi viser at nuc-gfp er sterkt uttrykt i nyre abscesser og avsløre heterogene genuttrykk grunn delvis til tilsynelatende romlige regulering av nuc promoter aktivitet i abscesser blir engasjert i immunforsvaret. Metoden kan brukes på alle bakterie med manipulatable genetisk system og noen infeksjon modell, gir verdifull informasjon for prekliniske studier og narkotika utvikling.

Introduction

Bakterier reagerer på endre fysiologiske forhold og endringer i miljøet ernæringsmessige staten ved narkotikalovgivningen uttrykke genene kreves for tilpasning og overlevelse. For eksempel koloniser opportunistiske patogener overflater ved relativt lav tetthet, og er ofte harmløse. Men når bakterien har trengt fysiske og kjemiske barrierer, må det kjempe med verten immun cellen mot forsvar og begrenset næringsstoffer tilgjengelighet1. Som et eksempel, Staphylococcus aureus colonizes omtrent en tredjedel av befolkningen asymptomatically men er også årsaken til ødeleggende huden og bløtvevet infeksjoner, osteomyelitt, endokarditt og bacteremia2. Suksess for S. aureus som en patogen er ofte knyttet til metabolske fleksibiliteten samt et arsenal av knyttet til overflaten, utskilles virulens faktorer som aktiverer bakterien rømme blodet og gjenskape i perifere vev 3,4,5. Verten død på grunn av stafylokokk sykdom er en evolusjonær blindspor og grenser overføring til nye verter6, må forpliktelse til virulens faktor produksjon bli nøye kontrollert.

En kompleks regulatoriske nettverk av proteiner og ikke-koding RNAs svarer til et utvalg av miljømessige stimuli, inkludert celle tetthet, vekstfase, nøytrofile-assosiert faktorer og næringsstoffer tilgjengelighet, slik at virulens gener som er uttrykt i den nøyaktig tid og sted i vert vev7,8,9,10,11,12,13. For eksempel regulerer tidlig/S to komponent systemet (TCS) uttrykk for virulens faktorer via sensor kinase (SaeS) og svar regulator (tidlig)14. SaeS er autophosphorylated på en bevart histidin rester svar til verten signaler (f.eks, menneskelige nøytrofile peptider [HNPs], calprotectin)8,15,16. Gruppen phosphoryl deretter overført til en aspartate rester tidlig aktivere det som en DNA-bindende protein (tidlig ~ P)17. Tidlig/S TCS regulerer over 20 gener som bidrar til patogenesen inkludert fibronectin binding proteiner (FnBPs), leukocidins og coagulase14,18,19,20. Mål kan klassifiseres i høy affinitet og lav-affinitet genet mål, som trolig indusert som tidlig ~ P stiger når de utsettes for sine signaler21. Tidlig/S aktiviteten er kontrollert av andre regulatorer av genuttrykk som tok quorum sensing systemet, repressor av giftstoffer protein (Rot) og alternativ sigma faktor B (SigB)22,23,24.

NUC er en Sae-avhengige virulens genet i Staphylococcus aureus og koder thermonuclease (Nuc), som er avgjørende for rømmer fra neutrophilic extracellular trapper (nett) og formidling under den løpet av infeksjon25,26. Uttrykk for nuc er også sterkt indirekte undertrykt av CodY i nærvær av forgrenede-kjeden aminosyrer og GTP27, og direkte undertrykt av stafylokokk tilbehør regulator protein SarA28,29 , der aktiviteten påvirkes av oksygen (redoks tilstand) og pH30. Gitt at sae og nuc mutanter er svekket i musen modeller av infeksjon, er det interesse for å utvikle kjemiske intervensjoner som hemmer deres tilsvarende aktiviteter26,31. Til tross for dette er det ingen informasjon om deres regulering under infeksjon.

Fluorescerende journalister har blitt brukt til å overvåke og kvantifisere genuttrykk på enkeltcelle nivå. Her presenterer vi en metode for å kvantifisere S. aureus genuttrykk under infeksjon, da sammen med i vitro transcriptome analyse og kraftig Bildeteknikker som magnetisk resonans imaging (MRI) og magnetisk resonans spektroskopi (MRS), kan avsløre hvordan bakteriell fysiologi er regulert i vivo og den relative abundances av næringsstoffer i enkelte nisjer. Metoden kan brukes på alle bakteriell patogen med en tett genetisk.

Oversikt over genomet integrerende vektoren.

Genomet integrerende vektor pRB4 inneholder 500 base parene hver fra oppstrøms og nedstrøms for S. aureus USA300 SAUSA300_0087 pseudogene å lette homologe rekombinasjon. pRB4 er avledet fra temperatur-sensitive pMAD vektor ryggraden som inneholder erythromycin motstand kassett (ermC) og thermostable beta-galactosidase gene bgaB for blå/hvit screening av recombinants32. Foretatt reporter Konstruer inneholder også en chloramphenicol motstand markør (katten) for valg etter genomet integrering og plasmider eliminering, samt EcoRI og SmaI områder å fusjonere regulatoriske regionen rundt superfolder Green fluorescerende protein (sGFP) (figur 1). Det er kjent at valg av ribosom bindende nettsted (RBS) påvirker aktiviteten til reporteren, og ofte krever empirisk optimalisering33. Dermed er en RBS ikke levert. Her, innfødt ribosom binding området brukes til å gi en mer naturlig mønsteret av genuttrykk, men andre steder kan brukes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) fra Georgetown University.

1. generasjon fluorescerende Reporter belastningen

  1. Fordøye genomet integrerende pRB4 vektoren sekvensielt med EcoRI og SmaI begrensning enzymer. Etter produsentens protokoll, sette opp en overnatting fordøyelsen med SmaI bruker 1 µg av pRB4 ved 25 ° C, og deretter fortsette med andre fordøyelsen 1t på 37 ° C ved å legge EcoRI til reaksjonsblandingen. Deaktiver enzymer av rugende ved 65 ° C i 20 min.
  2. PCR forsterke regulatoriske regionen rundt fra genomisk DNA (i dette tilfellet en ~ 350 base par DNA fragment som inneholder thermonuclease [nuc] promoter regionen), omfatter et 5' EcoRI begrensning og en 3 SmaI begrensning område. SmaI anerkjennelse rekkefølgen må være i-ramme med translasjonsforskning start codon. I denne studien PCR ble utført med en HiFi-DNA Polymerase i henhold til produsentens anbefalinger frem primer oRB015 (5'-atcattgaattctccaaagtaaattataagttatac-3 ") og reversere primer oRB016 ( 5-gggcataactaacacctctttctttttag-3 "). Annealing temperaturen var 53 ° C. Rense resulterende fragmentet bruker en PCR oppryddingen kit følge instruksjonene fra produsenten.
  3. Fordøye det resulterende PCR-produktet med EcoRI og SmaI som utført i trinn 1.1 og ligate fordøyd DNA fragmentet til samme nettstedene til pRB4 ved hjelp av T4 DNA ligase som anbefalt av produsenten til å generere den integrerende konstruere. Innføre ligation blandingen i E. coli og Bekreft konstruere sekvens.
  4. Electroporate konstruksjon i S. aureus belastning RN4220 som tidligere beskrevet34. I korthet, bruke 1 µg av plasmider med 70 µL av elektro-kompetent celler (100 Ω, 25 µF, og 2,3 kV) i B2 kjøttkraft (1% [w/v] kasein hydrolyse, 2,5% [w/v] gjærekstrakt, 2,5% [w/v] NaCl, 0,1% [w/v] K2PO4, 0,5% [w/v] glukose). Velg for erythromycin motstand (Emr) ved ettergivende temperatur (30 ° C) på tryptic soya agar (TSA) supplert med erythromycin (5 µg mL-1) og 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal, 80 µg mL-1). De resulterende transformants er blå skyldes plasmider-kodet β-galactosidase aktivitet.
    Merk: Overføring av DNA til kliniske isolater er ekstremt vanskelig på grunn av en sterk begrensning-endring barriere35. Dermed ble S. aureus RN4220 brukt som en mellomliggende mottakeren av fusion Konstruer fordi det er begrensning mangelfulle og svært transformable.
  5. Overføre plasmider til S. aureus USA300 belastning rundt med electroporation eller phage-mediert signaltransduksjon36 ved ettergivende temperatur. I korthet, overføre Φ11 bacteriophage partikler på donor belastningen med TSA plater som inneholder 5 mM CaCl2 overnatting på 30 ° C, og deretter sterilisere ved filtrering gjennom en 0,45 µM celluloseacetat sprøyte filter. Bruk lysates til å transduce S. aureus belastning LAC til Emr.
    Merk: LAC er en mye brukt kliniske isolere som ble tidligere laget Em følsom av føljetong passasjen i TSB medium å kurere belastningen av den opprinnelige plasmider pUSA03 som gir Emr 37,38.
  6. Integrere Konstruer av to påfølgende homologe rekombinasjon i kromosomet som beskrevet tidligere32. Recombinants er chloramphenicol-resistente (Cmr) på TSA plater som inneholder 5 μg mL-1 chloramphenicol, erythromycin-følsomme (Erms) og ingen lengre blå.
    Merk: Når re-introdusere merket fusjon i USA300 via phage-mediert signaltransduksjon å unngå akkumulering av mutasjoner knyttet i vitro belastning passasje39 og temperatur endringer.

2. dyr infeksjon: Forberedelse av Inoculum, systemisk infeksjon og vev behandling

  1. Utarbeidelse av bakteriell inoculum
    1. Strek S. aureus stammer rundt isolering på blod agar plater fra en frossen glyserol lager. Ruge på 37 ° C 16-24 h å bekrefte Hemolytisk fenotyper basert på deres evne til å lyse røde blodlegemer (RBCs) og skjemaet Fjern gjennomsiktig soner.
    2. Starte overnatting kulturer av vaksinere enkelt kolonier av hver stamme til 4 mL av tryptic soya kjøttkraft (TSB) i sterilt BILLEDRØR. Rotere rør ved 37 ° C i 16-24 h i en tube roller satt i ca en 70° vinkel og 70 rotasjoner per minutt [RPM].
    3. Bruker et spektrofotometer måle optisk densitet ved 600 nm (OD600) av kulturer fra trinn 2.1.2. Bruk sterilt medium som en optisk referanse (tom). Fortynne disse cellene til en OD600 0,05 i 25 ml av sterile Tryptic soya kjøttkraft (TSB) i separat, 125 mL DeLong flasker (5:1 kolbe til volumkontrollen) og ruge kulturer i et vannbad (for lated heten overføring til kulturer), rister på 280 RPM og satt til 37 ° C.
      Merk: Veksten av inoculum kan utføres på ulike måter; en metode for voksende celler til eksponentiell fase er presentert. Uansett, er det viktig bruke samme metode for å forberede cellene for vaksinering.
    4. På et OD600 ~ 1, nytt fortynne cellene i frisk medium en start OD600 av 0,05 å sikre cellene oppnå eksponentiell fase og at faktorer som akkumuleres i løpet av natten inkubasjon har blitt redusert til eksponentiell fase nivåer.
    5. Høste celler i eksponentiell fasen (OD600 ~0.6–0.8) av sentrifugering 3000 x g i 10 min ved romtemperatur.
    6. Vask pellets to ganger i tilsvarende volum av sterile 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS, pH 7.4).
    7. Suspendere cellene i 1 x PBS (pH 7.4) til en konsentrasjon av 1 x 108 kolonien danner enheter (CFUs) mL-1 eller avhengig av ønsket eksperimentere.
      Merk: er det viktig å bestemme forholdet mellom OD600 og CFU mL-1 for hver stamme av interesse fordi belastning-avhengige endringer av Cellestørrelse og form kan påvirke lysspredning egenskaper og til slutt, den infeksjon dose.
  2. Utarbeidelse av dyrene og bakteriell infeksjon
    1. Acclimate mus i 7 dager på renset kosthold AIN-93. Dietten er utviklet for å gi tilstrekkelig ernæring samtidig redusere vev auto-fluorescens forbundet med inntak av plante-baserte ingredienser i standardmus chow40.
      Merk: C57/BL6 hunnmus (6-8 uker gamle) er brukt her, men musen påkjenningen og sex vil avhenge av studien.
    2. Før infeksjon, dilate musen halen vener med lunkent vann.
    3. Infisere dyr av sprøytebruk 100 µL av bakteriell inoculum via hale-årer å produsere en systemisk infeksjon. Lagre en aliquot av den første inoculum hvis utfører flowcytometri (se Seksjon 4).
    4. Overvåke dyr daglig og vurdere deres helsestatus ved hjelp av et overvåkingssystem vurdert og godkjent av sin institusjonelle Animal Care og bruk komiteen.
    5. Tillate infeksjonen til fremgang for inn ønsket varighet. Her er eksperimenter avsluttet 3 dager etter smitte.
      Merk: Under disse forholdene består abscesser av en stafylokokk byllen fellesskap av bakterier, omsluttet av fibrin innskudd, og omgitt av konsentriske lag av immunceller5,41.
  3. Høsting organer og vev behandling
    1. Avlive dyrene av CO2 innånding og cervical forvridning som sekundær og utføre obduksjon.
    2. Høste nyre (høyre) og andre vitale organer (hjerte, lever, lunger, milt) og overføre til 15 mL polypropylen rør som inneholder 10% [v/v] bufret formalin. Fortsett med disse organene gå 2.3.4 nedenfor.
    3. Overføre venstre nyre til et sterilt 2 mL støtsikker rør som inneholder ~ 500 µL av 2 mm silica perler og 1 mL steril 1 x PBS (pH 7.4). Fortsett med denne organ med trinn 4.2.
    4. Tillate organer fra trinn 2.3.2 fikse i mørket ved romtemperatur med mild riste eller rotasjon for minst 24 timer, men ikke mer enn 48 timer.
    5. Bygg inn organer i klart vev frysing medium og lagre vev på-80 ° C.
    6. Bruke en kryostaten, delen vev i skiver av 10 µm tykkelse.
    7. Tørr delene på en pre renset, ladet objektglass for 20 min i mørket, bruke hard montering medium med 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) flekken, og bruke dekkglassvæske. Kurere montert lysbilder i romtemperatur over natten, og Overfør til 4 ° C for langtidslagring.

3. laserskanning AC Confocal mikroskopi og bildebehandling

  1. Undersøke montert lysbilder for å finne lesjoner med lasere passer for fluorescerende reporteren brukes. I dette tilfellet, grønn (GFP), rød (tdTomato) og blå (DAPI) fluorescens brukes signaler.
  2. Anskaffe bildet med riktige målet for å visualisere individuelle celler (f.eks vanligvis 20 x eller 40 x mål brukes).
  3. Måle fluorescens intensiteten i AC confocal bilder.
    1. Åpne AC confocal bildet i bildet J og justere lysstyrke/kontrast for å visualisere riktig fluorescens signalet av lesjonen.
    2. Definere en region av interesse, og ved hjelp av alternativet terskelverdi , sette nedre og øvre fluorescens grensene som nødvendig.
    3. Definer centroid ved å velge området → grå middelverdien → Centroid → begrense terskelen under kategorien analyser i bildet J.
    4. Ekstra centroid fluorescens intensitetsverdien eller måle mener fluorescens intensiteten i en gitt leksjonen per enhet (mener fluorescens intensitet, MFI) for GFP og tdTomato. Her ble deler av en µm2 brukt.
      Merk: En blendet andre analyse minimerer bias når identiteten til prøven er kjent.
    5. Tegne inn dataene og utføre de aktuelle statistiske analysene for hver sammenligning.

4. flyt cytometri analyse

  1. (Valgfritt) Bestemme fusion aktivitet av inoculum ved infeksjon (fra delen 2.2.3)
    1. 899 µL av 1 x sterilt PBS (pH 7.4) legge 100 µL av hver inoculum og 1 µL av membran permeant nukleinsyre flekken (se Tabell for materiale). Som en kontroll, må du inkludere en prøve mangler nukleinsyre flekken.
    2. Utføre flowcytometri på alle prøvene.
      Merk: For det første eksperimentet er det nyttig å inkludere en vektor bare kontroll for blanding av interesse å bestemme riktig spenning å bruke. Et klart skille mellom positive og negative prøver er viktig for dataanalyse, som angir reporteren er godt over bakgrunn signal.
    3. Finn befolkningen bakteriell, plottet hendelser med nukleinsyre flekker (y-aksen) og videresende punktdiagram (x-aksen).
    4. Tegne en inkludering gate rundt hendelser som er både nukleinsyre flekken positiv og riktig størrelse av basert på fremover scatter (mellom 0,5 til 2.0 µm for S. aureus).
      Merk: Være strenge når identifisere denne befolkningen som det er viktig å inkludere hendelser som er tydelig innen disse parameterne. Pass på at denne gate ekskluderer alle hendelser av negative kontrollene under andre forhold. I denne studien omtrent 70% celle befolkningen møtte disse kravene i analysen.
  2. Analyse av vevsprøver etter offer:
    1. Avlive dyrene, høste venstre nyrene (se trinn 2.3) og overføring til perle-juling rør som inneholder 1 mL 1 x sterilt PBS (pH 7.4) og 250 µL av 2 mm borosilicate perler.
    2. Forstyrre vev å løslate bakterielle celler. Nyrene, bruke en homogenizer for å forstyrre celler. Her ble tre 30 s støt ved 6800 rpm med 1 min kjøling perioder på våt is mellom sykluser brukt til å redusere oppvarming prøver.
    3. Pellet større vev rusk av sentrifugering 250 x g for 3 min i en tabletop microcentrifuge kjølt ned til 4 ° C.
      Merk: Det er vanligvis celle pellets på bunnen av røret og et lag av flytende avfall på toppen. Midten vandig laget inneholder bakterieceller.
    4. Overføre 10 µL fra vandig laget til en ren 1,5 mL microcentrifuge rør som inneholder 1 µL av nukleinsyre flekken i 989 µL av PBS (totalt volum 1 mL).
    5. Utføre flowcytometri med de samme data oppkjøpet parameterne og gating som for de første inocula.
      Merk: Bakteriell celletall blir svært lav fordi prøven hovedsakelig inneholder vev rusk. Alternativet "Live gate" kan også brukes hvis cellene nukleinsyre flekken positive og størrelse-gated når data er lastet inn i programmet. Dette vil også hjelpe å analysere flere av målet hendelsene og redusere filstørrelsen. Nesten en million hendelser per prøve telles, men mer hendelsen teller kan være nødvendig avhengig av alvorlighetsgraden av infeksjonen og størrelse av vev analysert.
    6. Dataanalyse: Bestemme mener fluorescerende intensitet (MFI) for hver fluorophore i et gitt utvalg med inkludering portene i delen 4.1.4. Normalisere prøver flyt analyseprogramvare til hendelsen teller. 10.000 teller er vanligvis tilstrekkelig i analysen.
      Merk: Det er ikke uvanlig å finne eksempler som inneholder mindre enn dette antallet hendelser siden dette er avhengig av abscess dannelse og infeksjon alvorlighetsgrad. Bruker denne tilnærmingen, 500-40,000 finnes hendelser vanligvis i infiserte vev.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi utviklet en plasmider avledet fra pMAD32 som kan levere en reporter fusion konstruksjon i kromosomet av double crossover homologe rekombinasjon (figur 1). Denne konstruksjonen gir kvantitativ analyse av noen regulerende område som støtter produksjon av GFP protein og fluorescerende signalet over bakgrunnen. Plasmider gir ampicillin motstand (Apr) for vedlikehold og forplantning i E. coli og gir erythromycin motstand (Emr) i S. aureus. Konstruer også gir chloramphenicol motstand (Cm-r), som tillater enkel overføring av integrert reporter fusjon mellom ulike mutant stammer for avansert genetisk analyse i S. aureus.

Som bevis på prinsippet, smeltet vi nuc regulatoriske regionen gfp. nuc ble valgt fordi gene produktet kreves for full virulens og kreves for begrense makrofager fra S. aureus -indusert abscesser42, 43. Konstruer var integrert i kromosomet som beskrevet i trinnene 1.4-1.6 av protokollen. Integrert fusion ble deretter overført til AH3926 som inneholder en PsarAP1- tdTomato blanding. SarA P1 arrangøren har vist tidligere å være constitutively aktive44 og dermed merker alle celler.

Vi først bekreftet at reporter fusjoner var aktiv under i vitro riste flasken vekst i Tryptic soya kjøttkraft (TSB, et rike, komplekse medium) og at nivåene av fluorescens var over mobilnettet auto-fluorescerende bakgrunnen (figur 2). For å avgjøre hvordan fluorescerende journalistene oppfører seg i vivo, var en modifisert nyre byllen modell brukte5. Grupper av kvinnelige C57BL/6 mus ble utfordret intravenøst med 1 x 107 CFU av S. aureus LAC celler mangler reporter fusjoner eller LAC celler med både nuc-sGFP og sarAp1-tdTomato fusjoner. Dyrene var ofret tre dager innlegget infeksjon. Deretter høstet organer ble fikset i 10% [v/v] bufret formalin, cryo-delt og fotografert av AC confocal mikroskopi etter DAPI farging som beskrevet i trinn 2 og 3 (Figur 3A, B). Bildene ble analysert ved hjelp av Image J og fluorescens per enhet i nyre lesjoner ble målt. Som vist i Figur 3C, var nuc-gfp fusion fluorescens i gjennomsnitt nesten 9-fold høyere i celler med fusion enn i cellene ikke bærer reporter fusion; sistnevnte signalet utgjør grensen for påvisning (auto-fluorescens) (sammenlign nuc-sGFP Lac). Tilsvarende PsarAP1- tdtomato fusion fluorescens var ~ 6-fold høyere enn ingen reporter kontrollen (Figur 3E, sammenligne sarAP1- tdT vs LAC). Bruker flowcytometri, mønsteret av reporteren aktiviteter ble bekreftet ved hjelp av nyre homogenates og flow cytometri som beskrevet i trinn 4, om fold forskjeller i fluorescens var lavere (Figur 3D, F).

Interessant, syntes fluorescens dataene fra lesjoner dannet av cellene med fluorescerende reporter fusjoner å vise høyere variabilitet enn de mangler journalister. Vi lurte på om variasjonen i fluorescens målingene observert skyldtes heterogene uttrykk for journalister (dvs om biologisk opprinnelse). Faktisk ~ 100 µm gangavstand ble det funnet at noen lesjoner uttrykt enten en eller begge journalister (Figur 4). Viktigere, undersøker reporter aktivitet med én celle oppløsning i stafylokokk byllen samfunn (SACs) avslørte romlige regulering av nuc uttrykk i abscesser omskrevet med sterk DAPI flekker, sannsynligvis den dannelse og utgivelsen av nøytrofile ekstracellulære overtrykkes (figur 5Vekselstrøm)45. For eksempel målt vi betydelig høyere nuc-sGFP fusion fluorescens i indre kjernen av SAC forhold til periferien (figur 5B, E). I den samme byllen, mønsteret for sarAp1-tdTomato fusion fluorescens syntes å være invertert (figur 5D). Men var mønsteret ikke statistisk signifikant bruker samme antall dyr (figur 5F).

Figure 1
Figur 1 : Skjematisk fremstilling av genomet integrerende reporter plasmider pRB4. Plasmider pRB4 er et derivat av pMAD med en temperatur følsom opprinnelsen til replikering i S. aureus (Ori pE194ts). Det er tre narkotika motstand markører: (i) bla, overdragelse motstand mot ampicillin i Escherichia coli; (ii) ermC, overdragelse erythromycin motstand i S. aureus; og (iii) katten, overdragelse motstand mot chloramphenicol i S. aureus. Reporter Konstruer er flankert av ~ 500 bp fra oppstrøms og nedstrøms sekvenser av pseudogene SAUSA300_0087 (referanse genom: FPR3757) for dobbel crossover homologe rekombinasjon og genom integrering. sGFP, grønne fluorescerende protein genet; CS, kloning området. TT, sterk toveis transcriptional terminator. Skikkelsen skala. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Jeg integrert NUC-sGFP og sarAp1-tdTomato journalister er uttrykt i i vitro vekst . S. aureus LAC celler (vill-type [WT]), med og uten (A) nuc -sGFP eller (B) sarAp1-tdTomato journalister) var vokst til eksponentiell fase i TSB og re utvannet til samme medium. Optisk tetthet (OD) og fluorescens ble målt på de angitte optisk densitet. Bakgrunn-trukket fluorescens intensitetsverdiene (eksitasjon/utslipp: sGFP, 485/535 nm; tdTomato [tdT], 535/590 nm) ble delt av de optiske densitet å generere Relative fluorescens enheter. Dataene er midler +/-SEM fra to uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Fluorescerende journalister er synlige i nyre vev. Grupper av 13 C57BL/6 mus ble utfordret intravenøst med LAC celler eller LAC celler med både nuc-sGFP og sarAp1-tdTomato (tdT)og infeksjonen var lov til å fortsette i tre dager. Mus var euthanized, og organer ble behandlet som beskrevet i trinn 2 og 3 av protokollen. Representant nyre delen viser flere lesjoner og den tilknyttede fluorescensen for (A) nuc-sGFP og (B) sarAp1-tdTomato. Skalere barer = 250 µm (10 x objektiv). Den Relative fluorescens enheter per enhet (RFU [μm2]-1) tilknyttet nyre lesjoner ble målt ved hjelp bildeanalyser som beskrevet i trinn 3.3 og var plottet for (C) nuc-sGFP og (E) sarAp1-tdTomato; hvert punkt representerer en lesjon og stolper angir medianen; 3-5 lesjoner analysert per musen. Flow cytometri analyse av (D) nuc-sGFP og (F) sarAp1-tdTomato fusion fluorescens bakteriell bestander isolert fra infiserte nyre homogenates tre dager innlegget infeksjon. Mener fluorescens intensitet (MFI) angis av solid bar, og hvert punkt er en nyre. LAC, reporterless vill-type belastning. Statistikk: Mann-Whitney Test; p < 0,05. Dataene er representant for to uavhengige eksperimenter. Eksitasjon bølgelengdene for fluorescens kanalene er som følger: DAPI, 405 nm; GFP, 488 nm; tdTomato, 561 nm. Slippes ut fluorescens data samlet inn over en rekke bølgelengder: DAPI, 419-481 nm; sGFP, 505-551 nm; tdTomato, 575-630 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Abscesser utstillingen variabel uttrykk for journalister i nyre vev. Grupper av 13 C57BL/6 mus ble utfordret med 1 x 107 CFU S. aureus celler via hale-venen. Dyrene var euthanized tre dager innlegget infeksjon. Nyrer ble høstet, fast og inndelte for fluorescens mikroskopi (40 x mål) som beskrevet i trinn 2 av protokollen. Vises tre lesjoner i nærheten med variabel (A) nuc-sGFP og (B) sarAp1-tdTomato fluorescens. (C) nukleinsyre fra stafylokokker og vert cellene angis av den DAPI flekker. De grønne og røde kanalene slås sammen i (D). Lignende resultater ble sett i andre deler. Bildene ble kjøpt med en 40 x målsetting; Skala bar = 25 µm. Eksitasjon bølgelengdene for fluorescens kanalene er som følger: DAPI, 405 nm; GFP, 488 nm; tdTomato, 561 nm. Slippes ut fluorescens data samlet inn over en rekke bølgelengder: DAPI, 419-481 nm; sGFP, 505-551 nm; tdTomato, 575-630 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : NUC-sGFP reguleres romlig i stafylokokk byllen mikro-miljøet. AC confocal laserskanning mikroskopi (CLSM) bilder av en stafylokokk byllen samfunnet (SAC) lesjon produsert av S. aureus belastning LAC bærer nuc-sGFP og sarAp1-tdTomato reporter fusjoner. Vises (A) flettes kanaler for nuc-sGFP og sarAp1-tdtomato, (B) nuc-sGFP fluorescens (grønn), (C) DAPI farging av nukleinsyrer (blå), og (D) sarAp1-tdTomato fluorescens (rød). Stjernene angir celler i kjernen (centroid) og piler indikerer celler i periferien. Fluorescens intensiteter for (E) nuc -sGFP og (F) sarAp1-tdTomato vises for cellene i kjernen og utkanten av SAC. Eksitasjon bølgelengdene for fluorescens kanalene er som følger: DAPI, 405 nm; GFP, 488 nm; tdTomato, 561 nm. Slippes ut fluorescens data samlet inn over en rekke bølgelengder: DAPI, 419-481 nm; sGFP, 505-551 nm; tdTomato, 575-630 nm. Dataene er avledet fra 8 nyrene (én per musen) og 1-2 lesjoner ble fotografert fra hver nyre. Stolper angir median. Stiplet linje grensen for påvisning. Statistikk: normalfordeling data, Student t-test (unpaired), ***p < 0,05. (Skala bar = 20 µm, gjelder for alle bilder.) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bakteriell infeksjonssykdommer er et økende helseproblem over hele verden på grunn av oppkjøpet av antibiotikaresistens determinanter46. Tilpasning til vertsmiljøer er avgjørende for vekst og overlevelse under infeksjon, kan strategier målretting gene expression programmer som øker patogen fitness være nyttig therapeutically. Et slikt program er et sett av gener som er kontrollert av tidlig/S to komponent system (TCS), vist tidligere å spille en viktig rolle i immunforsvaret evasion47. Tidlig/S er indusert av en rekke faktorer, spesielt de knyttet nøytrofile8,20. Under infeksjon utløser S. aureus en sterk betennelsesreaksjon som nøytrofile og andre phagocytes er rekruttert til området av smitte2. LNG nekrose og fibrin deponering følger, danner en byll for å forhindre flere vev skade48. Disse immun privilegert nettstedene Bruk S. aureus celler en rekke Sae-avhengige genet produkter for å omprogrammere byllen for å lette bakteriell multiplikasjon5,48. Sae-avhengige genet, nuc, koder for nuclease og metabolizes garn å produsere 2-deoxyadenosine å drepe makrofager43. Dermed er Nuc et viktig secreted enzym som er avgjørende for full virulens42 og er uttrykt i vivo (Figur 3 Figur 4og figur 5).

Selv om virulens faktorene av S. aureus har blitt studert grundig, er hvordan bakterien vokser i verten et lite studert område, som er å forstå hvordan fysiologi sin er regulert under infeksjon. Her beskriver vi en metode for sondering bakteriell genuttrykk og atferd på enkeltcelle nivået med en modifisert integrerende vektor som begrenser bekymring for plasmider tap i fravær av valg. Vår metode gir direkte visualisering av genuttrykk i abscesser uten å måtte permeabilize celle vegger, og uten behov for antistoffer og merking. Vi oppdaget sterke uttrykk nuc-sGFP fusion samt sarAp1-tdTomato fusion i nyre byllen SACs dannet av vill-type celler tre dager legge infeksjon i en akutt systemisk infeksjon modell. Eksperimentell design kan imidlertid endres for å svare på spørsmål om genuttrykk på andre websider. Faktisk, fordi C57BL/6 mus kan ikke fjerne S. aureus fra deres vev, bakterier invaderer ulike anatomiske nettsteder inkludert skjelettsystemet (bein og ledd) og hjerne, hjerte, milt og lever, alle har forskjellige fysiologi og nutritive egenskaper5,49. Dermed kan mye læres ved hjelp av S. aureus for å undersøke innholdet i vert vev. Det er viktig å merke seg at det er kjent at enkelte vert nisjer hypoxic i naturen eller ellers viser en sterk oksygen gradient50. Fluorescerende proteiner krever molekylær oksygen for aktivitet, og noen er mer følsomme for oksygen delvis press enn andre51. Mens vi ser fluorescens signal dypt i byllen, størrelsen kan være lavt. Bruke codon-optimalisert fluorescerende proteiner utviklet for bruk i Clostridium difficile kan brukes til å redusere denne bekymring52. En andre punkt å merke seg er at fluorescerende proteiner (sGFP og tdTomato) produsert av reporteren påkjenningen brukes i denne studien er stabil. Derfor gjenspeile fluorescerende dataene akkumulering i løpet av eksperimentet i stedet for en fersk respons. Generere en konstruksjon som inneholder en ustabil sGFP eller tdTomato gene ville øke nytten av systemet for dynamiske eksperimenter.

Reporter systemet beskrevet her gir et kraftig verktøy for å studere kvantitativt genet regulering i vitro og i vivo. Fordi reporteren opprettholdes i ett eksemplar på kromosomet, er systemet velegnet for sterkt uttrykt gener (som er, har høy promoter aktivitet). Biosyntetiske gener eller andre ydmyk uttrykt gener kan ikke vises fordi nivået av fluorescens uttrykk kan falle under grensen på oppdagelsen eller bakgrunn auto-fluorescens. Det er kjent at ribosom binding området (RBS) påvirker aktiviteten reporter fusjoner33. En mulig løsning på dette problemet er å bruke en sterkere RBS som oversettelse innvielsen regionen (TIR)53 eller integrere tandem kopier av arrangørene av interesse i kromosomet. Alternativt, stabil flere kopier plasmider kunne brukes54.

En begrensning av metoden beskrevet er at i motsetning til en cDNA forberedelse fra RNA utdraget fra vev, et relativt lite antall gener kan bli avhørt samtidig (begrenset av fluorescerende kanalene uten spectral overlapping). Men kan hva som er oppnådd være potensielt mer informativ. qRT PCR og andre readouts som gjennomsnittlig befolkningen bulk ikke klarer å fange befolkningen heterogenitet på stedet av infeksjonen. Faktisk observerte vi heterogenitet i nivået på nuc-sGFP og sarAp1-tdTomato uttrykk mellom byllen lesjoner i nærhet (Figur 4). Dette ligner på hva ble nylig rapportert av Cassat et al. 55 foreløpig opprinnelsen til denne heterogene er ikke kjent. Men kan næringsstoffer tilgjengelighet, variabel induksjon av næringsstoffer oppkjøpet systemer eller andre vert faktorer muligens forklare fenomenet. Videre skjer vert-patogen samspillet innen microenvironments organer eller abscesser komplekse tredimensjonale strukturen og ulike celletyper. Innenfor disse strukturene, kan vev variere betydelig med hensyn til pH, osmolaritet, oxygenation og næringsinnhold tilgjengelighet, et fenomen kjent som metabolske zonation56,57. Serendipitously oppdaget vi at et mønster av romlige oppstår i vill-type celler i byllen (figur 5). Dette er vi vet den første observasjonen av sitt slag i en Gram-positive patogen under infeksjon. Romlig regulering rapporterte her er lik som oppnås ved Davis et al. inneholder microcolonies av Gram-negative patogen Yersinia pseudotuberculosis58i splenic vev. I dette tilfellet, vert produsert nitrogenoksid (NO *) stimulert produksjonen av nitrogenoksid dioxygenase (Hmp) i cellene i utkanten av microcolony nærmest det spre nei *, sparsom interiør celler måtte induserer uttrykk for hmp. I stafylokokk abscesser er nuc uttrykket sterkeste kjernen av SAC, og svakeste langs periferien. Fordi abscesser er omgitt av en mansjett av nøytrofile, er det fristende å spekulere at nøytrofile-avledet signaler er veiledende virkemåten av stafylokokker, polariserende cellene i to svært forskjellige befolkningsgrupper om morphogenic regulering av differensiering under utvikling i høyere livet59. Den mekanistiske understøttelsen av dette mønsteret er ukjent, og er gjenstand for intens studie i vårt laboratorium.

Vi tror våre metoden gir et effektivt verktøy for å studere det fin detaljen av genuttrykk i enkeltceller under infeksjon. Metoden gir en unik mulighet til å observere og til slutt forstår fysiologiske opprinnelsen av heterogenitet og romlige mønstre av genuttrykk i vev. Dette heterogene må tas i betraktning når du utvikler nye behandlingsmetoder, som bare en subpopulasjon av celler (dvs.de uttrykke genene) kan bli målrettet av terapeutisk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi takker Alexander Horswill for gave PsarAP1- tdTomato fusion og Karen Creswell hjelp med flyt cytometri analyse. Vi takker også Alyssa King for råd om statistisk analyse. Dette arbeidet ble finansiert delvis av en NIH utforskende/utviklingsmessige forskning Award (stipend AI123708) og fakultetet oppstart fond til SRB. Fond ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og tolkning eller beslutningen om å sende arbeidet for publikasjonen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5% sheep blood Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA) A10
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) ThermoScientific R0402
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-25
C57Bl/6 Mice Charles River NA
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C-0378
confocal laser scanning microscope Zeiss NA
cryostat microtome Thermo Scientific NA
Culture, Cap VWR International 2005-02512
D+2:25NA Oligo Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) NA
DNA Ligase New England Biolabs M0202S
Erythromycin Sigma-Aldrich E5389
Flow Analyzer Becton Dickinson NA
glass beads Sigma Z273627
Miniprep, plasmid Promega A1220
orbital shaking water bath New Brunswick Innova NA
PCR purification QIagen 28106
Phosphate Buffer Saline (PBS) Cellgrow 46-013-CM
Plate reader Tecan NA
Precellys 24 homogenizer Bertin Laboratories NA
pUC57-Kan GenScript (Piscataway, NJ) NA
Q5 Taq DNA Polymerase New England Biolabs (Ipswich, MA) M0491S
Restriction Enzymes New England Biolabs (Ipswich, MA) R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
Reverse transcriptase New England BioLabs E6300L
Sanger Sequencing Genewiz (Germantown, MD) NA
Sub Xero clear tissue freezing medium Mercedes Medical MER5000
Superfrost Plus microscope slides Fisher Scientific 12-550-15
superloop GE Lifesciences 18111382
Syringe, Filter VWR International 28145-481
Syto 40 Thermo Fisher Scientific S11351 Membrane permeant nucleic acid stain
Tetracycline Sigma-Aldrich T7660
Tryptic Soy Broth VWR 90000-376
UV-visible spectrophotometer Beckman Coulter-DU350 NA
Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
  2. Lowy, F. Staphylococcus aureus infections. The New England Journal of Medicine. 339 (8), 520-532 (1998).
  3. Grosser, M. R., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus nitric oxide resistance and virulence. PLoS Pathogen. 14 (3), 1006907 (2018).
  4. Valentino, M., et al. Genes contributing to Staphylococcus aureus fitness in abscess- and infection-related ecologies. MBio. 5 (5), 01714-01729 (2014).
  5. Cheng, A., et al. Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues. FASEB Journal. 23 (10), 3393-3404 (2009).
  6. Meyers, L. A., Levin, B. R., Richardson, A. R., Stojiljkovic, I. Epidemiology, hypermutation, within-host evolution and the virulence of Neisseria meningitidis. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 270 (1525), 1667-1677 (2003).
  7. Balasubramanian, D., et al. Staphylococcus aureus Coordinates Leukocidin Expression and Pathogenesis by Sensing Metabolic Fluxes via RpiRc. MBio. 7 (3), 00818 (2016).
  8. Geiger, T., Goerke, C., Mainiero, M., Kraus, D., Wolz, C. The virulence regulator Sae of Staphylococcus aureus.: promoter activities and response to phagocytosis-related signals. Journal of Bacteriology. 190 (10), 3419-3428 (2008).
  9. Weiss, A., Broach, W. H., Shaw, L. N. Characterizing the transcriptional adaptation of Staphylococcus aureus. to stationary phase growth. Pathogens and Disease. 74 (5), (2016).
  10. Balaban, N., Novick, R. P. Autocrine regulation of toxin synthesis by Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (5), 1619-1623 (1995).
  11. Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: a regulatory link between metabolism and virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 191 (9), 2953-2963 (2009).
  12. Majerczyk, C. D., et al. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. Journal of Bacteriology. 190 (7), 2257-2265 (2008).
  13. McNamara, P. J., Milligan-Monroe, K. C., Khalili, S., Proctor, R. A. Identification, cloning, and initial characterization of rot, a locus encoding a regulator of virulence factor expression in Staphylococcus aureus. Journal of Bacteriology. 182 (11), 3197-3203 (2000).
  14. Liu, Q., Yeo, W. S., Bae, T. The SaeRS Two-Component System of Staphylococcus aureus. Genes (Basel). 7 (10), 81 (2016).
  15. Giraudo, A., Calzolari, A., Cataldi, A., Bogni, C., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus encodes a two-component regulatory system. FEMS Microbiology Letters. 177 (1), 15-22 (1999).
  16. Cho, H., et al. Calprotectin Increases the Activity of the SaeRS Two Component System and Murine Mortality during Staphylococcus aureus Infections. PLoS Pathogen. 11 (7), 1005026 (2015).
  17. Sun, F., et al. In the Staphylococcus aureus two-component system sae, the response regulator SaeR binds to a direct repeat sequence and DNA binding requires phosphorylation by the sensor kinase SaeS. Journal of Bacteriology. 192 (8), 2111-2127 (2010).
  18. Liang, X., et al. Inactivation of a two-component signal transduction system, SaeRS, eliminates adherence and attenuates virulence of Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 74 (8), 4655-4665 (2006).
  19. Giraudo, A. T., Cheung, A. L., Nagel, R. The sae locus of Staphylococcus aureus controls exoprotein synthesis at the transcriptional level. Archives of Microbiology. 168 (1), 53-58 (1997).
  20. Flack, C. E., et al. Differential regulation of staphylococcal virulence by the sensor kinase SaeS in response to neutrophil-derived stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (19), 2037-2045 (2014).
  21. Mainiero, M., et al. Differential target gene activation by the Staphylococcus aureus two-component system saeRS. Journal of Bacteriology. 192 (3), 613-623 (2010).
  22. Li, D., Cheung, A. Repression of hla by rot is dependent on sae in Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 76 (3), 1068-1075 (2008).
  23. Bischoff, M., et al. Microarray-based analysis of the Staphylococcus aureus sigmaB regulon. Journal of Bacteriology. 186 (13), 4085-4099 (2004).
  24. Novick, R., Jiang, D. The staphylococcal saeRS system coordinates environmental signals with agr quorum sensing. Microbiology. 149, Pt 10 2709-2717 (2003).
  25. Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  26. Berends, E., et al. Nuclease expression by Staphylococcus aureus facilitates escape from neutrophil extracellular traps. Journal of Innate Immunity. 2 (6), 576-587 (2010).
  27. Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 101 (3), 495-514 (2016).
  28. Cassat, J., et al. Transcriptional profiling of a Staphylococcus aureus clinical isolate and its isogenic agr and sarA mutants reveals global differences in comparison to the laboratory strain RN6390. Microbiology. 152, Pt 10 3075-3090 (2006).
  29. Kiedrowski, M., et al. Nuclease modulates biofilm formation in community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. PLoS One. 6 (11), 26714 (2011).
  30. Fujimoto, D. F., et al. Staphylococcus aureus SarA is a regulatory protein responsive to redox and pH that can support bacteriophage lambda integrase-mediated excision/recombination. Molecular Microbiology. 74 (6), 1445-1458 (2009).
  31. Yeo, W. S., et al. The FDA-approved anti-cancer drugs, streptozotocin and floxuridine, reduce the virulence of Staphylococcus aureus. Scientific Reports. 8 (1), 2521 (2018).
  32. Arnaud, M., Chastanet, A., Débarbouillé, M. New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformable, low-GC-content, Gram-positive bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 70 (11), 6887-6891 (2004).
  33. Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. Journal of Microbiological Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
  34. Schenk, S., Laddaga, R. A. Improved method for electroporation of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiology Letters. 73 (1-2), 133-138 (1992).
  35. Monk, I. R., Foster, T. J. Genetic manipulation of Staphylococci-breaking through the barrier. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2, 49 (2012).
  36. Novick, R. P. Genetic systems in staphylococci. Methods in Enzymology. 204, 587-636 (1991).
  37. Diep, B. A., et al. Complete genome sequence of USA300, an epidemic clone of community-acquired meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 367 (9512), 731-739 (2006).
  38. Boles, B. R., Thoendel, M., Roth, A. J., Horswill, A. R. Identification of genes involved in polysaccharide-independent Staphylococcus aureus biofilm formation. PLoS One. 5 (4), 10146 (2010).
  39. Villaruz, A. E., et al. A point mutation in the agr locus rather than expression of the Panton-Valentine leukocidin caused previously reported phenotypes in Staphylococcus aureus pneumonia and gene regulation. Journal of Infect Diseases. 200 (5), 724-734 (2009).
  40. Reeves, P. G., Nielsen, F. H., Fahey, G. C. J. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. Journal of Nutrition. 123 (11), 1939-1951 (1993).
  41. Thomer, L., Schneewind, O., Missiakas, D. Pathogenesis of Staphylococcus aureus Bloodstream Infections. Annual Review of Pathology. 11, 343-364 (2016).
  42. Olson, M., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infection and Immunity. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  43. Thammavongsa, V., Missiakas, D., Schneewind, O. Staphylococcus aureus degrades neutrophil extracellular traps to promote immune cell death. Science. 342 (6160), 863-866 (2013).
  44. Cheung, A. L., Nast, C. C., Bayer, A. S. Selective activation of sar promoters with the use of green fluorescent protein transcriptional fusions as the detection system in the rabbit endocarditis model. Infection and Immunity. 66 (12), 5988-5993 (1998).
  45. Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
  46. Uhlemann, A. C., Otto, M., Lowy, F. D., DeLeo, F. R. Evolution of community- and healthcare-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Infection, Genetics and Evolution. 21, 563-574 (2014).
  47. Voyich, J. M., et al. The SaeR/S gene regulatory system is essential for innate immune evasion by Staphylococcus aureus. Journal of Infectious Diseases. 199 (11), 1698-1706 (2009).
  48. Cheng, A., DeDent, A., Schneewind, O., Missiakas, D. A play in four acts: Staphylococcus aureus. abscess formation. Trends in Microbiology. 19 (5), 225-232 (2011).
  49. Balasubramanian, D., Harper, L., Shopsin, B., Torres, V. J. Staphylococcus aureus pathogenesis in diverse host environments. Pathogens and Disease. 75 (1), (2017).
  50. Vitko, N. P., Grosser, M. R., Khatri, D., Thurlow, L. R., Richardson, A. R. Expanded Glucose Import Capability Affords Staphylococcus aureus Optimized Glycolytic Flux during Infection. MBio. 7 (3), 00296 (2016).
  51. Landete, J. M., et al. Use of anaerobic green fluorescent protein versus green fluorescent protein as reporter in lactic acid bacteria. Applied Microbiology and Biotechnol. 99 (16), 6865-6877 (2015).
  52. Buckley, A. M., et al. Lighting Up Clostridium Difficile: Reporting Gene Expression Using Fluorescent Lov Domains. Scientific Reports. 6, 23463 (2016).
  53. Bose, J. L. Genetic manipulation of staphylococci. Methods in Molecular Biology. 1106, 101-111 (2014).
  54. Krute, C. N., et al. Generation of a stable plasmid for in vitro and in vivo studies of Staphylococcus. Applied and Environmental Microbiology. , 02370 (2016).
  55. Cassat, J. E., et al. Integrated molecular imaging reveals tissue heterogeneity driving host-pathogen interactions. Science Translational Medicine. 10 (432), 6361 (2018).
  56. Handlogten, M. E., Hong, S. P., Westhoff, C. M., Weiner, I. D. Apical ammonia transport by the mouse inner medullary collecting duct cell (mIMCD-3). American Journal of Physiology-Renal Physiology. 289 (2), 347-358 (2005).
  57. Hijmans, B. S., Grefhorst, A., Oosterveer, M. H., Groen, A. K. Zonation of glucose and fatty acid metabolism in the liver: mechanism and metabolic consequences. Biochimie Journal. 96, 121-129 (2014).
  58. Davis, K. M., Mohammadi, S., Isberg, R. R. Community behavior and spatial regulation within a bacterial microcolony in deep tissue sites serves to protect against host attack. Cell Host & Microbe. 17 (1), 21-31 (2015).
  59. Stenman, J. M., et al. Canonical Wnt signaling regulates organ-specific assembly and differentiation of CNS vasculature. Science. 322 (5905), 1247-1250 (2008).

Tags

Genetikk problemet 144 genekspresjon virulens fluorescens AC confocal mikroskopi histopatologi bakterier patogen romlig regulering Sae to komponent System nuclease nyre svulst
En fluorescens-basert metode å studere bakteriell Gene regulering i infiserte vev
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Behera, R. K., Mlynek, K. D., Linz,… More

Behera, R. K., Mlynek, K. D., Linz, M. S., Brinsmade, S. R. A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues. J. Vis. Exp. (144), e59055, doi:10.3791/59055 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter