Beskrevet her er en metode for å analysere bakteriell genuttrykk dyr vev på cellenivå. Denne metoden gir en ressurs for å studere fenotypiske mangfoldet innenfor en bakteriell befolkning svar på vev miljøet under en infeksjon.
Bakteriell virulens gener er ofte regulert på transcriptional nivå av flere faktorer som svarer til ulike Miljøsignaler. Noen faktorer handle direkte på virulens gener; andre kontrollere patogenesen ved å justere uttrykk for nedstrøms regulatorer eller akkumulering av signaler som påvirker regulator aktivitet. Mens regulering har vært studert under i vitro vekst, er relativt lite kjent om hvordan genuttrykk justeres under infeksjon. Slik informasjon er viktig når en bestemt gen er en kandidat for terapeutisk intervensjon. Transcriptional tilnærminger som kvantitative, real-time RT PCR og RNA-Seq er effektive måter å undersøke genuttrykk på globalt nivå men lider mange tekniske utfordringer, inkludert lav overflod av bakteriell forhold til verten RNA og utvalg degradering av RNases. Evaluere regulering med fluorescerende journalister er relativt lett og kan være multiplekset med fluorescerende proteiner med unike spectral egenskaper. Metoden gir encellede, spatiotemporal analyse av genuttrykk i vev som viser komplekse tredimensjonale arkitektur og physiochemical forløpninger som påvirker bakteriell regulatoriske nettverk. Slik informasjon er tapt når dataene er gjennomsnitt over bulk befolkningen. Her, beskriver vi en metode for å kvantifisere byggkorn under bakteriell patogener i situ. Metoden er basert på enkel vev behandling og direkte observasjon av fluorescens fra reporter proteiner. Vi viser nytten av dette systemet ved å undersøke uttrykket av Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), med gene produktet kreves for immun evasion og full virulens ex vivo og in vivo. Vi viser at nuc-gfp er sterkt uttrykt i nyre abscesser og avsløre heterogene genuttrykk grunn delvis til tilsynelatende romlige regulering av nuc promoter aktivitet i abscesser blir engasjert i immunforsvaret. Metoden kan brukes på alle bakterie med manipulatable genetisk system og noen infeksjon modell, gir verdifull informasjon for prekliniske studier og narkotika utvikling.
Bakterier reagerer på endre fysiologiske forhold og endringer i miljøet ernæringsmessige staten ved narkotikalovgivningen uttrykke genene kreves for tilpasning og overlevelse. For eksempel koloniser opportunistiske patogener overflater ved relativt lav tetthet, og er ofte harmløse. Men når bakterien har trengt fysiske og kjemiske barrierer, må det kjempe med verten immun cellen mot forsvar og begrenset næringsstoffer tilgjengelighet1. Som et eksempel, Staphylococcus aureus colonizes omtrent en tredjedel av befolkningen asymptomatically men er også årsaken til ødeleggende huden og bløtvevet infeksjoner, osteomyelitt, endokarditt og bacteremia2. Suksess for S. aureus som en patogen er ofte knyttet til metabolske fleksibiliteten samt et arsenal av knyttet til overflaten, utskilles virulens faktorer som aktiverer bakterien rømme blodet og gjenskape i perifere vev 3,4,5. Verten død på grunn av stafylokokk sykdom er en evolusjonær blindspor og grenser overføring til nye verter6, må forpliktelse til virulens faktor produksjon bli nøye kontrollert.
En kompleks regulatoriske nettverk av proteiner og ikke-koding RNAs svarer til et utvalg av miljømessige stimuli, inkludert celle tetthet, vekstfase, nøytrofile-assosiert faktorer og næringsstoffer tilgjengelighet, slik at virulens gener som er uttrykt i den nøyaktig tid og sted i vert vev7,8,9,10,11,12,13. For eksempel regulerer tidlig/S to komponent systemet (TCS) uttrykk for virulens faktorer via sensor kinase (SaeS) og svar regulator (tidlig)14. SaeS er autophosphorylated på en bevart histidin rester svar til verten signaler (f.eks, menneskelige nøytrofile peptider [HNPs], calprotectin)8,15,16. Gruppen phosphoryl deretter overført til en aspartate rester tidlig aktivere det som en DNA-bindende protein (tidlig ~ P)17. Tidlig/S TCS regulerer over 20 gener som bidrar til patogenesen inkludert fibronectin binding proteiner (FnBPs), leukocidins og coagulase14,18,19,20. Mål kan klassifiseres i høy affinitet og lav-affinitet genet mål, som trolig indusert som tidlig ~ P stiger når de utsettes for sine signaler21. Tidlig/S aktiviteten er kontrollert av andre regulatorer av genuttrykk som tok quorum sensing systemet, repressor av giftstoffer protein (Rot) og alternativ sigma faktor B (SigB)22,23,24.
NUC er en Sae-avhengige virulens genet i Staphylococcus aureus og koder thermonuclease (Nuc), som er avgjørende for rømmer fra neutrophilic extracellular trapper (nett) og formidling under den løpet av infeksjon25,26. Uttrykk for nuc er også sterkt indirekte undertrykt av CodY i nærvær av forgrenede-kjeden aminosyrer og GTP27, og direkte undertrykt av stafylokokk tilbehør regulator protein SarA28,29 , der aktiviteten påvirkes av oksygen (redoks tilstand) og pH30. Gitt at sae og nuc mutanter er svekket i musen modeller av infeksjon, er det interesse for å utvikle kjemiske intervensjoner som hemmer deres tilsvarende aktiviteter26,31. Til tross for dette er det ingen informasjon om deres regulering under infeksjon.
Fluorescerende journalister har blitt brukt til å overvåke og kvantifisere genuttrykk på enkeltcelle nivå. Her presenterer vi en metode for å kvantifisere S. aureus genuttrykk under infeksjon, da sammen med i vitro transcriptome analyse og kraftig Bildeteknikker som magnetisk resonans imaging (MRI) og magnetisk resonans spektroskopi (MRS), kan avsløre hvordan bakteriell fysiologi er regulert i vivo og den relative abundances av næringsstoffer i enkelte nisjer. Metoden kan brukes på alle bakteriell patogen med en tett genetisk.
Oversikt over genomet integrerende vektoren.
Genomet integrerende vektor pRB4 inneholder 500 base parene hver fra oppstrøms og nedstrøms for S. aureus USA300 SAUSA300_0087 pseudogene å lette homologe rekombinasjon. pRB4 er avledet fra temperatur-sensitive pMAD vektor ryggraden som inneholder erythromycin motstand kassett (ermC) og thermostable beta-galactosidase gene bgaB for blå/hvit screening av recombinants32. Foretatt reporter Konstruer inneholder også en chloramphenicol motstand markør (katten) for valg etter genomet integrering og plasmider eliminering, samt EcoRI og SmaI områder å fusjonere regulatoriske regionen rundt superfolder Green fluorescerende protein (sGFP) (figur 1). Det er kjent at valg av ribosom bindende nettsted (RBS) påvirker aktiviteten til reporteren, og ofte krever empirisk optimalisering33. Dermed er en RBS ikke levert. Her, innfødt ribosom binding området brukes til å gi en mer naturlig mønsteret av genuttrykk, men andre steder kan brukes.
Bakteriell infeksjonssykdommer er et økende helseproblem over hele verden på grunn av oppkjøpet av antibiotikaresistens determinanter46. Tilpasning til vertsmiljøer er avgjørende for vekst og overlevelse under infeksjon, kan strategier målretting gene expression programmer som øker patogen fitness være nyttig therapeutically. Et slikt program er et sett av gener som er kontrollert av tidlig/S to komponent system (TCS), vist tidligere å spille en viktig rolle i immunforsvaret evasion<sup c…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Alexander Horswill for gave PsarAP1– tdTomato fusion og Karen Creswell hjelp med flyt cytometri analyse. Vi takker også Alyssa King for råd om statistisk analyse. Dette arbeidet ble finansiert delvis av en NIH utforskende/utviklingsmessige forskning Award (stipend AI123708) og fakultetet oppstart fond til SRB. Fond ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og tolkning eller beslutningen om å sende arbeidet for publikasjonen.
5% sheep blood | Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA) | A10 | |
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | ThermoScientific | R0402 | |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
C57Bl/6 Mice | Charles River | NA | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C-0378 | |
confocal laser scanning microscope | Zeiss | NA | |
cryostat microtome | Thermo Scientific | NA | |
Culture, Cap | VWR International | 2005-02512 | |
D+2:25NA Oligo | Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) | NA | |
DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
Erythromycin | Sigma-Aldrich | E5389 | |
Flow Analyzer | Becton Dickinson | NA | |
glass beads | Sigma | Z273627 | |
Miniprep, plasmid | Promega | A1220 | |
orbital shaking water bath | New Brunswick Innova | NA | |
PCR purification | QIagen | 28106 | |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgrow | 46-013-CM | |
Plate reader | Tecan | NA | |
Precellys 24 homogenizer | Bertin Laboratories | NA | |
pUC57-Kan | GenScript (Piscataway, NJ) | NA | |
Q5 Taq DNA Polymerase | New England Biolabs (Ipswich, MA) | M0491S | |
Restriction Enzymes | New England Biolabs (Ipswich, MA) | R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI). | |
Reverse transcriptase | New England BioLabs | E6300L | |
Sanger Sequencing | Genewiz (Germantown, MD) | NA | |
Sub Xero clear tissue freezing medium | Mercedes Medical | MER5000 | |
Superfrost Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
superloop | GE Lifesciences | 18111382 | |
Syringe, Filter | VWR International | 28145-481 | |
Syto 40 | Thermo Fisher Scientific | S11351 | Membrane permeant nucleic acid stain |
Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
Tryptic Soy Broth | VWR | 90000-376 | |
UV-visible spectrophotometer | Beckman Coulter-DU350 | NA | |
Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |