संक्रमित ऊतकों में बैक्टीरियल जीन विनियमन का अध्ययन करने के लिए एक प्रतिदीप्ति आधारित विधि
Summary
यहां वर्णित एक सेलुलर स्तर पर पशु ऊतकों में बैक्टीरियल जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए एक विधि है । इस विधि एक संक्रमण के दौरान ऊतक पर्यावरण के जवाब में एक जीवाणु आबादी के भीतर होने वाली phenotypic विविधता का अध्ययन करने के लिए एक संसाधन प्रदान करता है ।
Abstract
बैक्टीरियल डाह जीन अक्सर कई कारकों है कि विभिंन पर्यावरणीय संकेतों का जवाब द्वारा transcriptional स्तर पर विनियमित रहे हैं । कुछ कारकों डाह जीन पर सीधे कार्य; दूसरों के बहाव नियामकों या संकेतों के संचय कि नियामक गतिविधि को प्रभावित की अभिव्यक्ति का समायोजन करके रोगजनन नियंत्रण । जबकि विनियमन बड़े पैमाने पर इन विट्रो विकास के दौरान अध्ययन किया गया है, अपेक्षाकृत कम कैसे जीन अभिव्यक्ति संक्रमण के दौरान समायोजित है के बारे में जाना जाता है । इस तरह की जानकारी महत्वपूर्ण है जब एक विशेष जीन उत्पाद चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए एक उंमीदवार है । मात्रात्मक, वास्तविक समय आरटी-पीसीआर और आरएनए-Seq तरह Transcriptional दृष्टिकोण एक वैश्विक स्तर पर जीन अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए शक्तिशाली तरीके हैं, लेकिन मेजबान आरएनए की तुलना में बैक्टीरियल आरएनए की कम बहुतायत सहित कई तकनीकी चुनौतियों से पीड़ित हैं, और नमूना RNases द्वारा ह्रास । विनियमन का मूल्यांकन फ्लोरोसेंट पत्रकारों का उपयोग अपेक्षाकृत आसान है और अद्वितीय वर्णक्रमीय गुणों के साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ मल्टीप्लेक्स किया जा सकता है । विधि एकल कोशिका के लिए अनुमति देता है, ऊतकों में जीन अभिव्यक्ति की spatiotemporal विश्लेषण है कि जटिल तीन आयामी वास्तुकला और physiochemical ढाल है कि बैक्टीरियल विनियामक नेटवर्क को प्रभावित प्रदर्शन । ऐसी जानकारी खो जाती है जब डेटा का औसत थोक जनसंख्या से अधिक हो । साथ ही, हम सीटू मेंजीवाणु रोगजनकों में जीन अभिव्यक्ति को बढ़ाता है के लिए एक विधि का वर्णन । विधि सरल ऊतक प्रसंस्करण और रिपोर्टर प्रोटीन से प्रतिदीप्ति के प्रत्यक्ष अवलोकन पर आधारित है । हम Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), जिसकी जीन उत्पाद प्रतिरक्षा चोरी और पूर्ण डाह पूर्व vivo और vivo में के लिए आवश्यक है की अभिव्यक्ति की जांच करके इस प्रणाली की उपयोगिता का प्रदर्शन । हम बताते हैं कि nuc-gfp दृढ़ता से गुर्दे फोड़े में व्यक्त की है और विषम जीन अभिव्यक्ति स्पष्ट रूप से प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के साथ लगे फोड़े में nuc प्रमोटर गतिविधि के स्थानिक विनियमन के लिए भाग में कारण प्रकट होता है । विधि एक हेर-फेर आनुवंशिक प्रणाली और किसी भी संक्रमण मॉडल के साथ किसी भी जीवाणु के लिए लागू किया जा सकता है, नैदानिक अध्ययन और दवा के विकास के लिए बहुमूल्य जानकारी प्रदान करते हैं ।
Introduction
जीवाणुओं को बदलने के लिए शारीरिक स्थितियों और उनके पर्यावरण के पोषण राज्य में परिवर्तन करने के लिए अंतर से अनुकूलन और अस्तित्व के लिए आवश्यक जीन व्यक्त करने का जवाब । उदाहरण के लिए, अवसरवादी रोगजनकों उपनिवेश शरीर अपेक्षाकृत कम घनत्व पर सतहों, और अक्सर हानिरहित हैं । हालांकि, एक बार जीवाणु शारीरिक और रासायनिक बाधाओं प्रवेश किया है, यह मेजबान प्रतिरक्षा सेल काउंटर के साथ संघर्ष-गढ़ और सीमित पोषक तत्वों की उपलब्धता1होगा । एक उदाहरण के रूप में, Staphylococcus aureus उपनिवेश करता आबादी के लगभग एक तिहाई स्पर्शोन्मुख है, लेकिन यह भी विनाशकारी त्वचा और कोमल ऊतक संक्रमण, अस्थिमज्जा, अन्तर्हृद्शोथ, और bacteremia2के कारण है । एक रोगज़नक़ के रूप में aureus की सफलता अक्सर इसके चयापचय लचीलापन के साथ ही सतह से जुड़े और स्रावित डाह कारकों है कि जीवाणु खून से बचने के लिए और परिधीय ऊतकों में नकल करने के लिए सक्षम के एक शस्त्रागार के लिए जिंमेदार ठहराया है 3,4,5. क्योंकि मेजबान मौत स्ताफ्य्लोकोच्कल रोग के कारण एक विकासवादी मर अंत और नई मेजबान6के लिए संचरण की सीमा है, डाह कारक उत्पादन के लिए प्रतिबद्धता सावधानी से नियंत्रित किया जाना चाहिए ।
प्रोटीन और गैर कोडिंग RNAs के एक जटिल नियामक नेटवर्क सेल घनत्व, विकास चरण, न्युट्रोफिल जुड़े कारकों, और पोषक तत्वों की उपलब्धता, यह सुनिश्चित करने के लिए कि डाह जीन पर व्यक्त कर रहे है सहित पर्यावरणीय उत्तेजनाओं की एक किस्म का जवाब सटीक समय और मेजबान ऊतकों के भीतर स्थान7,8,9,10,11,12,13. उदाहरण के लिए, SaeR/S दो घटक सिस्टम (TCS) सेंसर कळेनासे (SaeS) और प्रतिक्रिया नियामक (SaeR)14के माध्यम से कई डाह कारकों की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है । SaeS (जैसे, मानव न्युट्रोफिल पेप्टाइड्स [HNPs], calprotectin)8,15,16होस्ट संकेतों के जवाब में एक संरक्षित histidine अवशेषों पर autophosphorylated है । phosphoryl समूह तो SaeR पर एक aspartate अवशेषों को हस्तांतरित किया है, यह एक डीएनए के रूप में सक्रिय-बाध्यकारी प्रोटीन (SaeR ~ P)17। SaeR/एस टीसीएस 20 जीन है कि fibronectin बंधन प्रोटीन (FnBPs), leukocidins, और coagulase14,18,19,20सहित रोगजनन के लिए योगदान पर नियंत्रित करता है । लक्ष्य उच्च संबंध और कम समानता जीन लक्ष्य है, जो SaeR के स्तर के रूप में प्रेरित कर रहे है में वर्गीकृत किया जा सकता है ~ पी उगता है जब अपने संकेतों को उजागर21। SaeR/एस गतिविधि Agr कोरम संवेदन प्रणाली के रूप में जीन अभिव्यक्ति के अंय नियामकों द्वारा नियंत्रित किया जाता है, विषाक्त पदार्थों के प्रोटीन के दमन (सड़ांध), और वैकल्पिक सिग्मा कारक बी (SigB)22,23,24।
nuc Staphylococcus aureus में एक Sae-निर्भर डाह जीन है और encodes thermonuclease (nuc), जो एनeutrophilic ईxtracellular टीraps (जाल) से बचने के लिए और के दौरान प्रसार के लिए आवश्यक है संक्रमण का कोर्स25,26. nuc की अभिव्यक्ति भी मजबूती से शाखाई-चेन अमीनो एसिड और GTP27की उपस्थिति में कोड़ी द्वारा अप्रत्यक्ष रूप से दमित है, और सीधे स्ताफ्य्लोकोच्कल गौण नियामक प्रोटीन सारा28,29 द्वारा दमित , जिनकी सक्रियता ऑक्सीजन (redox state) और pH30से प्रभावित होती है । यह देखते हुए कि sae और nuc म्यूटेंट संक्रमण के माउस मॉडलों में तनु हैं, वहां रासायनिक हस्तक्षेप है कि उनकी इसी गतिविधियों को रोकना26,31के विकास में रुचि है । बावजूद इसके संक्रमण के दौरान उनके नियमन के संबंध में कोई जानकारी नहीं है ।
फ्लोरोसेंट पत्रकारों की निगरानी और एकल कोशिका स्तर पर जीन अभिव्यक्ति यों तो इस्तेमाल किया गया है । साथ ही, हम एसबढ़ाता के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । संक्रमण के दौरान aureus जीन अभिव्यक्ति है कि, जब इन विट्रो transcriptome विश्लेषण और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) और चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (श्रीमती) की तरह शक्तिशाली इमेजिंग तकनीक के साथ युग्मित, प्रकट कर सकते हैं कैसे बैक्टीरियल फिजियोलॉजी vivo में विनियमित है और कुछ niches में पोषक तत्वों के सापेक्ष बहुतायत । विधि एक तंत्रीय आनुवंशिक प्रणाली के साथ किसी भी जीवाणु रोगज़नक़ के लिए लागू किया जा सकता है ।
जीनोम एकीकरण वेक्टर का अवलोकन ।
जीनोम एकीकृत वेक्टर pRB4 है ५०० आधार जोड़े प्रत्येक के ऊपर और नीचे के क्षेत्रों से एस aureus USA300 SAUSA300_0087 pseudogene के लिए मुताबिक़ पुनर्संयोजन की सुविधा । pRB4 तापमान के प्रति संवेदनशील pMAD वेक्टर इरिथ्रोमाइसिन प्रतिरोध कैसेट (ermC) और thermostable बीटा galactosidase जीन bgaB नीले/recombinants३२की सफेद स्क्रीनिंग के लिए युक्त रीढ़ से ली गई है । इंजीनियर रिपोर्टर का निर्माण भी जीनोम एकीकरण और प्लाज्मिड उंमूलन के बाद चयन के लिए एक क्लॉरॅंफेनिकोल प्रतिरोध मार्कर (cat), साथ ही साथ EcoRI और SmaI साइटों को superfolder ग्रीन को ब्याज की नियामक क्षेत्र फ्यूज होता है फ्लोरोसेंट प्रोटीन (sGFP) (चित्रा 1) । यह ज्ञात है कि ribosome बंधन साइट (आरबीएस) के चुनाव रिपोर्टर की गतिविधि को प्रभावित करती है, और अक्सर अनुभवजंय अनुकूलन३३की आवश्यकता है । इस प्रकार, एक आरबीएस की आपूर्ति नहीं की है । यहां, देशी ribosome बंधन साइट जीन अभिव्यक्ति की एक और अधिक प्राकृतिक पैटर्न के लिए प्रदान किया जाता है, लेकिन अंय साइटों का इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
बैक्टीरियल संक्रामक रोगों एक बढ़ती स्वास्थ्य समस्या एंटीबायोटिक प्रतिरोध निर्धारकों४६के अधिग्रहण के कारण दुनिया भर रहे हैं । क्योंकि वातावरण की मेजबानी के लिए अनुकूलन विकास और संक्रमण के…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पीsarAP1-tdTomato फ्यूजन के उपहार के लिए अलेक्जेंडर Horswill धंयवाद, और करेन Creswell प्रवाह cytometry विश्लेषण के साथ मदद के लिए । हम भी सांख्यिकीय विश्लेषण पर सलाह के लिए एलिसा राजा धंयवाद । इस काम के हिस्से में एक NIH खोजपूर्ण/विकासात्मक अनुसंधान पुरस्कार (अनुदान AI123708) और SRB के लिए संकाय स्टार्टअप कोष द्वारा वित्त पोषित किया गया । funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और व्याख्या, या प्रकाशन के लिए काम प्रस्तुत करने का निर्णय में कोई भूमिका नहीं थी ।
Materials
| 5% sheep blood | Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA) | A10 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | ThermoScientific | R0402 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| C57Bl/6 Mice | Charles River | NA | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C-0378 | |
| confocal laser scanning microscope | Zeiss | NA | |
| cryostat microtome | Thermo Scientific | NA | |
| Culture, Cap | VWR International | 2005-02512 | |
| D+2:25NA Oligo | Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) | NA | |
| DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E5389 | |
| Flow Analyzer | Becton Dickinson | NA | |
| glass beads | Sigma | Z273627 | |
| Miniprep, plasmid | Promega | A1220 | |
| orbital shaking water bath | New Brunswick Innova | NA | |
| PCR purification | QIagen | 28106 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgrow | 46-013-CM | |
| Plate reader | Tecan | NA | |
| Precellys 24 homogenizer | Bertin Laboratories | NA | |
| pUC57-Kan | GenScript (Piscataway, NJ) | NA | |
| Q5 Taq DNA Polymerase | New England Biolabs (Ipswich, MA) | M0491S | |
| Restriction Enzymes | New England Biolabs (Ipswich, MA) | R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI). | |
| Reverse transcriptase | New England BioLabs | E6300L | |
| Sanger Sequencing | Genewiz (Germantown, MD) | NA | |
| Sub Xero clear tissue freezing medium | Mercedes Medical | MER5000 | |
| Superfrost Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| superloop | GE Lifesciences | 18111382 | |
| Syringe, Filter | VWR International | 28145-481 | |
| Syto 40 | Thermo Fisher Scientific | S11351 | Membrane permeant nucleic acid stain |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Tryptic Soy Broth | VWR | 90000-376 | |
| UV-visible spectrophotometer | Beckman Coulter-DU350 | NA | |
| Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |
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