JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Traducción Automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

Anaerobik Protein Saflaştırma ve DesB Dioxygenase etkinliği ve inhibisyon çalışmak için oksijen elektrodu ile kinetik Analizi

Published: October 03, 2018
doi:
10.3791/58307
, , , ,
1Department of Chemistry,Wesleyan University

Summary

Burada anaerobik protein saflaştırma, anaerobik protein konsantrasyonu ve bir oksijen elektrot sistemi kullanarak sonraki kinetik karakterizasyonu için bir iletişim kuralı mevcut. Yöntem enzim DesB, daha istikrarlı ve etkin saflaştırılmış ve anaerobik bir ortamda bir dioxygenase enzim kullanarak gösterilmiştir.

Abstract

Oksijen duyarlı proteinler, oksijen bir substrat olarak kullanan bu enzimler de dahil olmak üzere geleneksel Aerobik arıtma yöntemleri kullanarak saf zaman istikrar azaltılabilir. Bu makale tamponlar ve reaktifler, sütun Kromatografi için yöntemleri hazırlanması bir torpido ve kinetik önce protein desalting Anaerobik arıtma işlemi, ilgili teknik ayrıntılar gösterir. Ayrıca açıklanan hazırlama ve oksijen kullanan enzim kinetik karakterizasyonu gerçekleştirmek için bir oksijen elektrot kullanarak yöntemlerdir. Bu yöntemler dioxygenase enzim DesB, bakteri Sphingobium sp. zorlanma SYK-6 dan gallat dioxygenase kullanarak gösterilmiştir.

Introduction

Demir veya oksijen etkinleştirmek için diğer metaller enzimlerin kez onların kaldırılması nedeniyle azalan bakiyeli bir hücre ortamından inactivation arıtma işlemi sırasında yatkındır. Bu nedenle, bu proteinler hücre lysates kullanılması gerekir, dış azalan bakiyeli acentelere tabi veya anaerobik en uygun enzimatik aktivite1,2,3,4olması için saf. Çoğu bu enzimler için oksijen anaerobik koruyarak tüm arıtma ve karakterizasyonu adımları gerçekleştirme duyarlı (enzimler) özellikle demir içeren, tam olarak onları tanımlamak gereklidir. Bu araştırmacılar tüm Laboratuvar set-up anaerobik salonları protein ifade ile kristalografisi5,6,7,8 arasında değişen çalışmaları için sınırları içinde geliştirmek için neden olmuştur .

Burada, biz yöntemleri anaerobik arıtma ve enzim bir oksijen elektrot sistemi kullanarak DesB kinetik karakterizasyonu için rapor. DesB gallat dioxygenase bakteri Sphingobium sp. zorlanma LigAB, protocatecuate dioxygenase aynı organizmadan ilgili SYK-6 dan var. Her iki enzim olan kapsamlı tarihi9, kısmen ne zaman standart aerobik kullanarak saf inactivation için duyarlı olmak bu süper enzimler nedeniyle büyük olasılıkla araştırılmamıştır tip II protocatechuate dioxygenase (PCAD) süper ait protein saflaştırma yöntemleri. Süre diğer substrat özel2,10, are biraz PCAD enzim substrat karışıklık göstermek bu yana daha fazla bu süper karakterizasyonu özgüllük belirleyicileri tanımlamak gereklidir. Birkaç enzim superfamilies11,12,13,14,15‘ te gözlemlediği gibi küçük moleküller ile doğrudan rekabet inhibisyon aktivitesi veya bağlama alter molekülleri artışa neden olmaktadır allosteric cepler ayırmak veya enzimatik aktivite16azaltmak için. Kinetik yalnız bir modülatör ciltleme konumu ayırt edemez, bir etkinlik değişikliğin büyüklüğünü belirleme etkileri anlamak için önemlidir. Yerli DesB etkinliği ve faaliyete 4-nitrocatechol (4NC), karakterize ve dioxygenase enzimler2,17, inhibe için yaygın olarak kullanılan bir bileşik huzurunda kinetik karakterizasyonu böyle, yöntemleri 18, gösterilir.

DesB gallat, bir lignin elde edilen aromatik bileşik yolu ile extradiol dioxygenase (EDO) reaksiyon hangi ringde oksijen yüzeylerde10,19biri olarak kullanarak açılış katalizlenir yıkmak yapabiliyor. Bu enzimatik reaksiyon bir aromatik heteropolymer bitkiler hücre duvarında bulunan lignin, dağılımı bağlamında oluşur. Lignin depolymerized, aromatik bileşikler çeşitli verimli daha fazla merkezi metabolitleri3,20,21,22,23,24 bölünebilir ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol dioxygenases (EDO) bir halka dihydroxylated aromatik bileşikler, bölünme bitişik metal koordine diol oluştuğu bir tepki açılış katalizler; Buna ek olarak, intradiol dioxygenases iki hidroksil grubu (Şekil 1) benzer aromatik bileşikler ayırmak. EDOs, birçok diğer metaloenzimlerde gibi bir iki-histidin, bir-karboksilat Triad’ın9,34,35oluşan koordinasyon Fe(II) için bir divalent metal merkezi var. Enzim etkin olmayan2,36,37,38işlenir, ancak bu metaloenzimlerde, autoxidation veya inactivation mekanizması tabanlı, okside olur.

Bu el yazması açıklanan deneysel yordamlar, biz DesB, PCAD süper gallat (Şekil 2A) C4-C5 bağ arasında oksijen eklenmesiyle katalizler için bakteri Sphingobium sp. SYK-6, üzerinden bir üyesi kullanmaktadır. Bu dekolte regiochemistry bir protocatechuate-4, 5-dioxygenase (Şekil 2B) olduğu LigAB için benzerdir. Şimdiye kadar bu gallat dioxygenase araştırmalar hiçbir rapor DesB10,19,39inhibe bileşikleri içerir. Anaerobik yöntemlerin kullanımı ile biz sürekli tekrarlanabilir aktivite ile protein almak mümkün iken Aerobik arıtma yöntemleri kullanımı ile değişken etkinlik, DesB sergiledi. Burada açıklanan kinetik çalışmalar DesB, DesB gallat ile reaksiyon ve DesB inhibisyonu 4-nitrocatechol (4NC) tarafından kinetik karakterizasyonu anaerobik arıtma için yöntemleri gösterir.

Protocol

1. genel malzeme ve Yöntemler Gerekli ortam Tablo 1′ de açıklandığı şekilde hazırlayın. Otoklav 120 ˚C 15 dk. steril, MgCl2 ve glikoz, eklenmesinden sonra 0.2 µm filtreden geçirerek SOC çözüm filtre uygulayın. Miller’ın Lysogeny suyu (LB medya) çözüm ısıyla önce pH ayarlayın. LB-Amp medya çözüm ısıyla 0.2 mm L-sistein, sonra 0,1 mM demir amonyum protein ifade ve çözünürlük artırmak için sülfat steril çözümleri ile sonra ek. Laemmli ta…

Representative Results

Gösterilen SDS-sayfa jel saflaştırılması maltoz DesB bağlayıcı protein (MBP) füzyon yapı (Şekil 3) üzerinden bireysel kesirler analizidir. Jel protein saf olduğunu ortaya koymaktadır (MW 91.22 kDa =), DesB varlığı dışında (MW 49.22 kDa =) ve MBP protein etki alanı (42 kDa) birbirinden i ciddi. Kesirler E2 ve E3 konsantrasyonu (adım 4.2) için seçildi. DesB kinetik deneyleri te…

Discussion

Aktif, saf DesB protein almak üzere kritik adımlar oluşturan ve enzim azaltılmış Fe(II) aktif sitesinin bakımı içerir. Bu nedenle, indüksiyon, arıtma, konsantrasyon performansını düzeltmek ve desalting adımları başarıyla etkin enzim elde etmek için gereklidir. Protein ifade 1 mM demir amonyum sülfat huzurunda inducing Fe(II) doğru DesB aktif dahil sağlar. Bu yöntem genellikle metal uygun katlama izin vermek için büyüme ortamına ilavesi ve tam doluluk sitesi6,<…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Camille Dr.Keller Wesleyan Üniversitesi Teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. Anaerobik protein saflaştırma yöntemleri ve bir O2 kullanımı ile ilgili onların tavsiye için özel Profesör Lindsay D. Eltis ve Jenna K. Capyk British Columbia Üniversitesi gibi Christian Whitman Austin, Texas Üniversitesi teşekkür -hassas elektrot.

Materials

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranodise Gold Bio Technologies I2481C50
Coomassie Brilliant Blue R-250 Bio-Rad 161-0400
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700
30% Acrylamide Bio-Rad 161-0158
N,N'tetramethyl-ethylenediamine Bio-Rad 161-0801
Amylose Resin High Flow New England Biolabs E8022S
BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells New England Biolabs C2527I
L-cysteine Sigma Aldrich C7352
gallic acid Sigma Aldrich G7384
4-nitrocatechol Sigma Aldrich N15553
Ferrous ammonium sulfate Mallinckrodt 5064
Sodium dithionite Alfa Aesar 33381-22
wheaton serum bottles Fisher Scientific 06-406G
25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane Pall Corportation 4187
400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator EMD Millipore UFSC40001
76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter EMD Millipore PLGC07610
DL-dithiothreitol Gold Bio Technologies DTT50
Sephadex G-25 coarse desalting gal column GE Healthcare 17-0033-01
2 mL Crimp-Top Vials Fisher Scientific 03-391-38
Oxygraph Plus Electrode Control Unit Hansatech Instruments OXYG1 Plus
Oxygen Eletrode Chamber Hansatech Instruments DW1
Electrode Disc Hansatech Instruments S1
PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel Hansatech Instruments S4
Electrode cleaning Kit Hansatech Instruments S16
Spacer paper Zig Zag available at any gas station
He-series Dri-Lab glove box Vacuum/Atmospheres Company
HE-493 Dri-Train Vacuum/Atmospheres Company
Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula Fisher Scientific 21-401-10
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column Fisher Scientific k420400-1530
10 μL, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe Hamilton 80300
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column Fisher Scientific K420401-1505
Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer Avestin
B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent Thermo Fisher Scientific 89821
Lysozyme from chicken egg white Sigma Aldrich 12650-88-3
Sodium dodecyl sulfate Thermo Fisher Scientific 151-21-3
ampicillin Sigma Aldrich 7177-48-2
Tryptone Fisher Scientific BP-1421-500
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-10
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-3
Magnesium Chloride Fisher Scientific M33-500
Dextrose Fisher Scientific D16-3
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-1
Tris hydrochloride Fisher Scientific BP153-500
Maltose Fisher Scientific BP684-500
Glycine Fisher Scientific G46-500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Awaya, J. D., Walton, C., Borthakur, D. The pydA-pydB fusion gene produces an active dioxygenase-hydrolase that degrades 3-hydroxy-4-pyridone, an intermediate of mimosine metabolism. Applied Microbiology and Biotechnology. 75 (3), 583-588 (2007).
  2. Barry, K. P., Taylor, E. A. Characterizing the Promiscuity of LigAB, a Lignin Catabolite Degrading Extradiol Dioxygenase from Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Bioquímica. 52 (38), 6724-6736 (2013).
  3. Colabroy, K. L., Smith, I. R., Vlahos, A. H. S., Markham, A. J., Jakubik, M. E. Defining a kinetic mechanism for l-DOPA 2,3 dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from Streptomyces lincolnensis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1844 (3), 607-614 (2014).
  4. Imsand, E. M., Njeri, C. W., Ellis, H. R. Addition of an external electron donor to in vitro assays of cysteine dioxygenase precludes the need for exogenous iron. Archives of Biochemistry and Biophysics. 521 (1), 10-17 (2012).
  5. Tsai, C. -. L., Tainer, J. A., David, S. S. . Methods in Enzymology. 599, 157-196 (2018).
  6. Kuchenreuther, J. M., et al. High-Yield Expression of Heterologous [FeFe] Hydrogenases in Escherichia coli. Public Library of Science ONE. 5 (11), e15491 (2010).
  7. Dupuy, J., et al. Crystallization and preliminary X-ray diffraction data for the aconitase form of human iron-regulatory protein 1. Acta Crystallographica Section F. 61 (5), 482-485 (2005).
  8. Fan, L., et al. XPD Helicase Structures and Activities: Insights into the Cancer and Aging Phenotypes from XPD Mutations. Cell. 133 (5), 789-800 (2008).
  9. Vaillancourt, F. H., Bolin, J. T., Eltis, L. D. The ins and outs of ring-cleaving dioxygenases. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 41, 241-267 (2006).
  10. Sugimoto, K., et al. Molecular Mechanism of Strict Substrate Specificity of an Extradiol Dioxygenase, DesB, Derived from Sphingobium sp. SYK-6. Public Library of Science ONE. 9 (3), e92249 (2014).
  11. Lewis-Ballester, A., et al. Structural insights into substrate and inhibitor binding sites in human indoleamine 2,3-dioxygenase 1. Nature Communications. 8, (2017).
  12. Lipscomb, J. D., Hoffman, B. M. Allosteric control of O-2 reactivity in Rieske oxygenases. Structure. 13 (5), 684-685 (2005).
  13. Mccray, J. A., Brady, F. O. Allosteric Control of Transient Kinetics of Carbon Monoxide-L-Tryptoohan-2,3-Dioxygenase Complex-Formation. Federation Proceedings. 32 (3), 469 (1973).
  14. Pearson, J. T., Siu, S., Meininger, D. P., Wienkers, L. C., Rock, D. A. In Vitro Modulation of Cytochrome P450 Reductase Supported Indoleamine 2,3-Dioxygenase Activity by Allosteric Effectors Cytochrome b(5) and Methylene Blue. Bioquímica. 49 (12), 2647-2656 (2010).
  15. Walsh, H. A., Daya, S. Inhibition of hepatic tryptophan-2,3-dioxygenase: Superior potency of melatonin over serotonin. Journal of Pineal Research. 23 (1), 20-23 (1997).
  16. Barry, K. P., et al. Exploring allosteric activation of LigAB from Sphingobium sp strain SYK-6 through kinetics, mutagenesis and computational studies. Archives of Biochemistry and Biophysics. 567, 35-45 (2015).
  17. Reynolds, M. F., et al. 4-Nitrocatechol as a probe of a Mn(II)-dependent extradiol-cleaving catechol dioxygenase (MndD): comparison with relevant Fe(II) and Mn(II) model complexes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 8 (3), 263-272 (2003).
  18. Tyson, C. A. 4-Nitrocatechol as a colorimetric probe for non-heme iron dioxygenases. Journal of Biological Chemistry. 250 (5), 1765-1770 (1975).
  19. Kasai, D., Masai, E., Miyauchi, K., Katayama, Y., Fukuda, M. Characterization of the gallate dioxygenase gene: Three distinct ring cleavage dioxygenases are involved in syringate degradation by Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Journal of Bacteriology. 187 (15), 5067-5074 (2005).
  20. Billings, A. F., et al. Genome sequence and description of the anaerobic lignin-degrading bacterium Tolumonas lignolytica sp. nov. Standards in Genomic Sciences. 10 (1), 106 (2015).
  21. Brown, M. E., Chang, M. C. Y. Exploring bacterial lignin degradation. Current Opinion in Chemical Biology. 19, 1-7 (2014).
  22. Bugg, T. D. H., Ahmad, M., Hardiman, E. M., Rahmanpour, R. Pathways for degradation of lignin in bacteria and fungi. Natural Product Reports. 28 (12), 1883-1896 (2011).
  23. Clarkson, S. M., et al. Construction and Optimization of a Heterologous Pathway for Protocatechuate Catabolism in Escherichia coli Enables Bioconversion of Model Aromatic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 83 (18), (2017).
  24. de Gonzalo, G., Colpa, D. I., Habib, M. H. M., Fraaije, M. W. Bacterial enzymes involved in lignin degradation. Journal of Biotechnology. 236, 110-119 (2016).
  25. Falade, A. O., Eyisi, O. A. L., Mabinya, L. V., Nwodo, U. U., Okoh, A. I. Peroxidase production and ligninolytic potentials of fresh water bacteria Raoultella ornithinolytica and Ensifer adhaerens. Biotechnology Reports. 16, 12-17 (2017).
  26. Gall, D. L., Ralph, J., Donohue, T. J., Noguera, D. R. A Group of Sequence-Related Sphingomonad Enzymes Catalyzes Cleavage of β-Aryl Ether Linkages in Lignin β-Guaiacyl and β-Syringyl Ether Dimers. Environmental Science & Technology. 48 (20), 12454-12463 (2014).
  27. Li, J., Yuan, H., Yang, J. Bacteria and lignin degradation. Frontiers of Biology in China. 4 (1), 29-38 (2009).
  28. Masai, E., Katayama, Y., Nishikawa, S., Fukuda, M. Characterization of Sphingomonas paucimobilis SYK-6 genes involved in degradation of lignin-related compounds. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 23, 364-373 (1999).
  29. Morales, L. T., González-García, L. N., Orozco, M. C., Restrepo, S., Vives, M. J. The genomic study of an environmental isolate of Scedosporium apiospermum shows its metabolic potential to degrade hydrocarbons. Standards in Genomic Sciences. 12 (1), 71 (2017).
  30. Shettigar, M., et al. Isolation of the (+)-Pinoresinol-Mineralizing Pseudomonas sp. Strain SG-MS2 and Elucidation of Its Catabolic Pathway. Applied and Environmental Microbiology. 84 (4), (2018).
  31. Shi, Y., et al. Characterization and genomic analysis of kraft lignin biodegradation by the beta-proteobacterium Cupriavidus basilensis B-8. Biotechnology for Biofuels. 6 (1), 1 (2013).
  32. Varman, A. M., et al. Decoding how a soil bacterium extracts building blocks and metabolic energy from ligninolysis provides road map for lignin valorization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), E5802-E5811 (2016).
  33. Wu, W., et al. Lignin Valorization: Two Hybrid Biochemical Routes for the Conversion of Polymeric Lignin into Value-added Chemicals. Scientific Reports. 7 (1), 8420 (2017).
  34. Koehntop, K. D., Emerson, J. P., Que, L. The 2-His-1-carboxylate facial triad: a versatile platform for dioxygen activation by mononuclear non-heme iron(II) enzymes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 10 (2), 87-93 (2005).
  35. Lipscomb, J. D. Mechanism of extradiol aromatic ring-cleaving dioxygenases. Current Opinion in Structural Biology. 18 (6), 644-649 (2008).
  36. Machonkin, T. E., Doerner, A. E. Substrate specificity of Sphingobium chlorophenolicum 2,6-dichlorohydroquinone 1,2-dioxygenase. Bioquímica. 50, 8899-8913 (2011).
  37. Suzuki, T., Kawamichi, H., Imai, K. Amino Acid Sequence, Spectral, Oxygen-Binding, and Autoxidation Properties of Indoleamine Dioxygenase-Like Myoglobin from the Gastropod Mollusc Turbo cornutus. Journal of Protein Chemistry. 17 (8), 817-826 (1998).
  38. Vaillancourt, F. H., Labbe, G., Drouin, N. M., Fortin, P. D., Eltis, L. D. The Mechanism-based Inactivation of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by Catecholic Substrates. Journal of Biological Chemistry. 277 (3), 2019-2027 (2002).
  39. Sugimoto, K., et al. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of gallate dioxygenase DesB from Sphingobium sp. SYK-6. Acta Crystallographica Section F. 65 (11), 1171-1174 (2009).
  40. Gallagher, S. R. SDS‐Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. 6 (1), 7.3.1-7.3.28 (2012).
  41. Xiang, D. F., et al. Function Discovery and Structural Characterization of a Methylphosphonate Esterase. Bioquímica. 54 (18), 2919-2930 (2015).
  42. Vladimirova, A., et al. Substrate Distortion and the Catalytic Reaction Mechanism of 5-Carboxyvanillate Decarboxylase. Journal of the American Chemical Society. 138 (3), 826-836 (2016).
  43. Korczynska, M., et al. Functional Annotation and Structural Characterization of a Novel Lactonase Hydrolyzing d-Xylono-1,4-lactone-5-phosphate and l-Arabino-1,4-lactone-5-phosphate. Bioquímica. 53 (28), 4727-4738 (2014).
  44. Netto, L. E. S., Stadtman, E. R. The Iron-Catalyzed Oxidation of Dithiothreitol Is a Biphasic Process: Hydrogen Peroxide Is Involved in the Initiation of a Free Radical Chain of Reactions. Archives of Biochemistry and Biophysics. 333 (1), 233-242 (1996).
  45. Arciero, D. M., Orville, A. M., Lipscomb, J. D. Protocatechuate 4,5-Dioxygenase from Pseudomonas testosteroni. Methods in Enzymology. 188, 89-95 (1990).
  46. Harpel, M. R., Lipscomb, J. D. Gentisate 1,2-dioxygenase from pseudomonas. Purification, characterization, and comparison of the enzymes from Pseudomonas testosteroni and Pseudomonas acidovorans. Journal of Biological Chemistry. 265 (11), 6301-6311 (1990).
  47. Ishida, T., Tanaka, H., Horiike, K. Quantitative structure-activity relationship for the cleavage of C3/C4-substituted catechols by a prototypal extradiol catechol dioxygenase with broad substrate specificity. Journal of Biochemistry. 135 (6), 721-730 (2004).
  48. Vaillancourt, F. H., Han, S., Fortin, P. D., Bolin, J. T., Eltis, L. D. Molecular Basis for the Stabilization and Inhibition of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by t-Butanol. Journal of Biological Chemistry. 273 (52), 34887-34895 (1998).
  49. Veldhuizen, E. J. A., et al. Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase. Biochemical Journal. 386, 305-314 (2005).
  50. Wolgel, S. A., et al. Purification and Characterization of Protocatechuate 2,3-Dioxygenase from Bacillus macerans: a New Extradiol Catecholic Dioxygenase. Journal of Bacteriology. 175 (14), 4414-4426 (1993).

Tags

AnaerobicProtein PurificationKinetic AnalysisOxygen ElectrodeDesB DioxygenaseEnzyme ActivityInhibitionInorganic BiochemistryOxygen-sensitive MetalsProtein ExpressionCell PelletAmylose ColumnLysozymeHigh-pressure HomogenizationNitrogen GasGlove BoxAmylose Column BufferElution BufferFerrous Ammonium SulfateDithiothreitol

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Uchendu, S. N., Rafalowski, A., Cohn, E. F., Davoren, L. W., Taylor, E. A. Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition. J. Vis. Exp. (140), e58307, doi:10.3791/58307 (2018).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image